معلومة

لماذا يجب عليك استخدام درجة حرارة التلدين حوالي 5 درجات مئوية تحت Tm من البادئات الخاصة بك؟


لماذا يجب عليك استخدام درجة حرارة التلدين حوالي 5 درجات مئوية أقل من Tm من البادئات الخاصة بك؟

وفقًا لبحثي الحالي ، أعتقد أن له علاقة بالمواد المتفاعلة الأخرى في تفاعل البوليميراز المتسلسل ، لكنني لست متأكدًا.


أنت تريد أن يكون لديك مواد أولية تلتزم في ظل ظروف رد الفعل فقط بتسلسل اهتمامك. إذا ذهبت بعيدًا جدًا عن درجة حرارة التلدين المثلى (5 درجات مئوية أقل من Tm هو بالفعل خيار جيد نسبيًا في تجربتي) ، فإن إرادتك تؤثر على كفاءة تفاعل البوليميراز المتسلسل وبالتالي عائد تفاعلك.

تسمح درجة حرارة التلدين ، التي تكون منخفضة للغاية ، بتليين المواد الأولية إلى مواقع أخرى غير الهدف المقصود مع التلدين الجزئي أو عدم تطابق القاعدة الداخلية. هذا يؤدي إلى تضخيم غير محدد وعوائد أقل.

إذا كانت درجة حرارة التلدين عالية جدًا ، فلن يحدث ربط تمهيدي ولن تحصل على منتج PCR. بدلاً من ذلك ، يمكن أن يؤدي الارتباط الجزئي أيضًا إلى منتجات غير صحيحة ، على الرغم من أن هذا أقل احتمالًا بكثير من عدم الحصول على أي منتج على الإطلاق.


تُعرَّف درجة حرارة التلدين في مادة التمهيدي بأنها درجة الحرارة التي يرتبط فيها 50٪ من النيوكليوتيدات في المادة الأولية بالحمض النووي. إن نسبة التلدين بنسبة 50٪ لن تسفر عن منتج أمثل لمعاهدة التعاون بشأن البراءات. وهكذا ، عن طريق خفض درجة الحرارة بحوالي 5 درجات مئوية ، تتغير نسبة الطلاء التمهيدي المربوط إلى أكثر من 50٪ (ربما حوالي 70-80٪) وبالتالي الحصول على عائد أكثر دقة.

هذا هو السبب في أننا نطرح 5 درجات مئوية من درجة حرارة التلدين النظرية.


أهمية درجة حرارة الانصهار في تطبيقات البيولوجيا الجزيئية

تعرف على كيفية توقع درجات حرارة الانصهار المناسبة وتحديدها لخطوات تهجين oligo ، بما في ذلك تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

درجة حرارة انصهار ثنائي قليل النوكليوتيد أو T.م، هي درجة الحرارة التي يكون فيها نصف جزيئات قليل النوكليوتيد أحادي الجديلة والنصف الآخر مزدوج الشريطة ، أي أن قليل النوكليوتيد يكون بنسبة 50٪ ملدنًا إلى مكمله الدقيق. تيم هي معلمة مهمة يجب مراعاتها عند تصميم وتنفيذ العديد من تجارب البيولوجيا الجزيئية ، بما في ذلك PCR و qPCR.

اختيار درجة حرارة انصهار البرايمر

التنبؤ الدقيق لـ Tم يحدد الدوبلكس التي من المحتمل أن تتشكل في درجات حرارة معينة ، مما يسمح لك بتحديد معلمات التدوير الحراري المناسبة. أثناء مرحلة التلدين لـ PCR ، يجب أن تكون درجة حرارة التفاعل منخفضة بدرجة كافية للسماح لكل من الاشعال الأمامي والخلفي بالارتباط بالقالب ، ولكن ليس منخفضًا بحيث يمكن تكوين دبابيس شعر غير مرغوب فيها أو غير محددة أو دبابيس شعر داخل الجزيئية ، وكلاهما مما يقلل من كفاءة التفاعل. يجب اختيار كلا البادئين في PCR ليكون لهما T مماثلم. توصي IDT باختيار درجة حرارة التلدين 5 & ndash7 & degC تحت أدنى درجة حرارة Tم.

اختيار مسبار درجة حرارة انصهار

يتطلب تصميم فحوصات qPCR باستخدام مجسات مزدوجة الملصقات أيضًا تنسيقًا دقيقًا للتمهيدي T.م. عندما تنخفض درجة حرارة التفاعل من تغيير الطبيعة إلى التلدين أثناء التدوير ، يحتاج المسبار إلى التصلب أولاً إلى الهدف. إذا ارتبط المسبار بالهدف في نفس الوقت أو بعد ربط البادئات ، فقد يبدأ البوليميراز في تكرار الهدف الذي لا يحتوي على مسبار مرتبط. نتيجة لذلك ، سيتم تصنيع الحمض النووي الجديد دون تدهور المجس المصاحب ، وبالتالي لن يتم اكتشافه كزيادة في التألق. مثل هذا الموقف يؤدي إلى بيانات غير دقيقة. بالنسبة إلى qPCR القياسي ، توصي IDT بمسبار يحتوي على T.م 5 & ​​ndash10 درجة مئوية أعلى من T.م من الاشعال.

تحقق مرة أخرى من نشر Tم البيانات

من المهم التحقق من حرف T.م من أي متواليات قليلة النوكليوتيد مستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل حتى عندما تم أخذ مجموعة تمهيدي ومسبار ناجحة سابقًا مباشرة من منشور. قد يتضمن تصميم مثل هذه التسلسلات المنشورة Tم معززات مثل رابط البستان الصغير أو قواعد الحمض النووي المقفلة. مجموعةم المُحسِنات ليست ضرورية لتحليل التعبير الجيني ، يمكن تصميم مجموعات المسبار غير المعدلة ومجموعة التمهيدي التي توفر بيانات موثوقة ودقيقة لنفس الأهداف دون تكلفة إضافية لإجراء تعديلات غير ضرورية.

توقع Tم

ما هي أفضل وأسهل طريقة لتوقع T.م؟ أداة OligoAnalyzer من IDT ، الموجودة في قسم تطبيقات SciTools على موقعنا الإلكتروني ، هي نتيجة للبحث المستمر والابتكار. يأخذ في الاعتبار آثار قليل النوكليوتيد ، الكاتيون ، dNTP ، وتركيزات الملح ، وتسلسل قليل النوكليوتيد ، وتفاعلات الجار الأقرب. يتيح أخذ كل هذه العوامل في الاعتبار التنبؤ الدقيق بأوليغنوكليوتيد T.م محددة لظروف رد فعلك [1]. لمزيد من المعلومات حول الحسابات والخوارزمية المستخدمة بواسطة أداة OligoAnalyzer ، ارجع إلى التقرير الفني IDT ، حساب Tم لدوبلكس قليل النوكليوتيد.


بروتوكول

إعداد رد الفعل:

أضف إلى أنبوب PCR معقم رقيق الجدران:

مكون 25 وماكرول
رد فعل
50 وماكرول
رد فعل
أخير
تركيز
5X EpiMark & ​​reg Hot Start
طق رد الفعل العازلة
5 وماكرول 10 وماكرول 1X
10 ملم dNTPs 0.5 وماكرول 1 وماكرول 200 ميكرومتر
10 & microM Forward Primer 0.5 وماكرول 1 وماكرول 0.2 ميكرومتر
(0.05-1 ميكرو متر)
10 & microM عكس التمهيدي 0.5 وماكرول 1 وماكرول 0.2 ميكرومتر
(0.05-1 ميكرو متر)
EpiMark & ​​reg Hot Start طق
بوليميريز الحمض النووي
0.125 وماكرول 0.25 وماكرول 1.25 وحدة /
50 وماكرول PCR
قالب DNA عامل عامل & لتر 1000 نانوغرام
مياه خالية من نوكلياز إلى 25 وماكرول إلى 50 وماكرول

ملاحظات: قم بخلط التفاعل برفق. اجمع كل السوائل في قاع الأنبوب عن طريق الدوران السريع إذا لزم الأمر. غلف العينة بالزيت المعدني في حالة استخدام آلة تفاعل البوليميراز المتسلسل بدون غطاء ساخن.

انقل أنابيب PCR إلى جهاز تدوير وابدأ التدوير الحراري:

شروط التدوير الحراري لـ PCR الروتيني:

الأولي تمسخ:
95 درجة مئوية 30 ثانية

35-40 دورة:
95 درجة مئوية 15 & ndash30 ثانية
45 & ndash68 & degC 15 & ndash60 ثانية
68 درجة مئوية 1 دقيقة لكل كيلو بايت

التمديد النهائي:
68 درجة مئوية 5 دقائق


الاشعال TM - (24 يونيو 2007)

أهلا
عند تحسين منتجات PCR ، أستخدم درجة حرارة التلدين التي تكون أعلى أو أسفل TM من التمهيدي ، لكن أحد زملائي أخبرني أنه لا ينبغي أن أستخدم التلدين أعلى من TM & # 33 & # 33 & # 33 & # 33
هل هذا صحيح ؟ و لماذا ؟

يجب أن تكون درجة حرارة التلدين أقل من tm.

Tm هي درجة الحرارة التي يتم عندها تلدين نصف البادئات الخاصة بك إلى حبلاها التكميلية (القالب). فوق tm ، وتحصل على أقل من النصف. وكلما قل عدد الجزيئات التي قمت بتثبيتها في القالب ، ستنخفض عائدات PCR.

ومع ذلك ، فمن الصحيح أنه في بعض الأحيان تحصل على منتج أفضل مع التلدين أعلى من البادئات TM لبعض الأسباب.
وأخبرني زميلي ، أن بعض المقايسات تتطلب درجات حرارة أعلى حتى تعمل على النحو الأمثل. لكن هذا ليس خط توجيهي عام.
عادةً ما أجرب 4 درجات كلاسيكية أقل من Tm (كما يحسب بواسطة primer3) كضربة أولى ثم تحسينها أكثر.
اضبط التلدين في نطاق من درجات الحرارة المنخفضة إلى تلك القريبة من Tm وإذا لاحظت انخفاضًا في كمية أو جودة المنتج ، يمكنك ببساطة اختيار أفضل درجة حرارة. ولكن إذا قمت بضبط هذا المنتج ويبدو أنه أفضل وأفضل ، فاستمر في درجة حرارة أعلى كما يحلو لك.
لكن بشكل عام حاول فقط أولئك الذين هم تحت Tm.

كان ما أفهمه أنه يعتمد على الإنزيم وحجم التمهيدي. أيضًا ، هناك عدة طرق مختلفة لحساب Tm. أذهب إلى موقع الويب الخاص بالبرايمر الذي أستخدمه وحساب التمهيدي Tm بطريقتهم ، ثم استخدم إدراج المنتج لتحديد درجة حرارة التلدين التي سأستخدمها.

في الواقع ، هذا نوع من المبالغة - أنا في الواقع فقط أستخدم دورة PCR القياسية الخاصة بي مع درجة حرارة صلبة تبلغ 53 درجة مئوية ، وإذا لم ينجح ذلك ، فأنا أبدأ في العبث بدرجة حرارة التلدين

مرحبًا ، أسهل طريقة للعثور على درجة حرارة التلدين المثلى هي القيام بتدرج PCR. في بعض الأحيان ، يمكن أن تكون درجة حرارة التلدين المثلى أعلى من Tm. على سبيل المثال ، كان Tm لزوج واحد من البرايمر حوالي 55 درجة مئوية. لكن درجة حرارة التلدين المثلى كانت بشكل حاد 58.8 درجة مئوية ، كما يتضح من التدرج PCR. لذلك ، اخترت 58.8 درجة حرارة التلدين وحصلت على نتائج جيدة جدًا.

عندما لا تعمل درجات الحرارة تحت Tm بشكل صحيح ، فإنني أقوم أيضًا بإجراء التدرج PCR ، أعني. أقوم بضبط PCR لزيادة درجة الحرارة في كل دورة. وفي أغلب الأحيان تحل المشكلة.
لكن لدي سؤال أيضًا. عندما تفعل هذا ، كيف تعرف ما هو أفضل ذاكرة ترجمة. لأن الآلة تزيد من درجة الحرارة في كل مرة. ليس من السهل معرفة ذلك؟

أعتقد أن ما تشير إليه هو هبوط PCR ، والذي يختلف عن التدرج PCR. باستخدام التدرج PCR ، يمكنك ضبط كل عمود من الآبار / المواضع في جهاز PCR الخاص بك على درجة حرارة محددة ، ثم عند تشغيل المنتجات على مادة هلامية لتحديد أي منها يعمل ، ستكون قد سجلت الموضع في الجهاز الذي كان الأنبوب - وذاك هي درجة الحرارة المثلى.

هل يمكن أن تخبرني من فضلك كيف أفعل التدرج PCR؟
وما نوع جهاز pCR الذي يمكنه القيام بذلك؟

أستخدم دورة PCR مبرمجة على جهاز Biorad icycler الخاص بنا والذي تم إنشاؤه بواسطة عضو آخر في المختبر ، لذا فأنا لا أعرف بالفعل كيفية إعداد واحدة من الصفر. يمكنك محاولة استشارة دليل جهازك ، أو التحدث إلى مندوب من الشركة التي صنعته ؟؟


درجات حرارة التلدين التمهيدي - (21 أغسطس 2012)

لدي درجتان مختلفتان من درجات حرارة التلدين للاشعال (59 و 55). ما هي درجة حرارة التلدين التي يجب أن أقوم بضبطها عندما أكون في PCR عند استخدام مجموعة البرايمر هذه؟

أستخدم هذا الموقع لحساب Tm:
http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/Default.aspx
هناك العديد من الخوارزميات التي تؤدي إلى نتائج مختلفة. مع تحديد Tms هنا ، أحصل على المتوسط ​​- 5 درجة مئوية للتلدين عندما أستخدم Taq polymerase (خطوة التحلل 30 ثانية)
احرص على أنه إذا كان لديك متدرجات (تسلسلات إضافية تريد إضافتها إلى التسلسل الخاص بك من خلال PCR) ، فأنت بحاجة إلى حساب Tm فقط للجزء المطابق من البادئات. لهذا الغرض ، أستخدم Phusion: Tm أعلى لكلا البادرين (تسلسل المطابقة) + 5 & deg C touch down -0.7 & degC / دورة 15 ثانية خطوة التلدين هذا لـ 14 خطوة متبوعة بـ 6 خطوات أخرى لديك: Tm أقل لكلا البادئات (احسب Tm للتسلسل الكامل) (15 ثانية لكل خطوة)

معقد جدا بالنسبة لي. أنا أصلب في 55 درجة مئوية.

ابدأ بـ 55 ، إذا كان المنتج في حالة غير محددة يزيد درجة حرارة التلدين بمقدار درجتين في المرة الواحدة. التي يجب أن تعمل

الخطوة 1: يصلب في 55
الخطوة 2: (اختياري) قم بعمل التلدين المتدرج PCR من 50 إلى 68
الخطوة 3: تخلص من البرايمر ، وأعد تصميم البرايمر.

الحياة أقصر من أن تتعامل مع الاشعال الهامشي.

وعادة ما تفعل..
الخطوة 1: يصلب في 60
الخطوة الثانية: 5٪ DMSO
الخطوة 3: نسيت .. منذ زمن بعيد

لماذا إعادة تصميم البرايمر؟ تلك هي مواد أولية جيدة تمامًا. لقد أجريت اختبار PCR مرة واحدة باستخدام مواد أولية واحدة في 46 والآخر عند 71 (قصة طويلة ، لكنني لم أستطع تصميمها بشكل أفضل بغض النظر عما فعلته ، وعانيت كثيرًا). عملت على أكمل وجه. لكني & # 39m الشخص الذي يحتوي على برنامج PCR معقد للغاية. تصميم الاشعال بنفس درجة حرارة التلدين قديم جدًا. ما يمكن أن تفعله أجهزة تدوير PCR في الوقت الحاضر من أجلك مع ما نعرفه عن PCR يمكن بسهولة حل مشكلة PCR بدرجات حرارة صلبة مختلفة. وبالمناسبة: 4 درجات لا شيء.

أنا أيضًا مع التلدين المتدرج الذي اقترحه phage434. ومع ذلك ، لا تستثمر جميع المعامل في مثل هذه الوظيفة لجهاز PCR. (من المؤكد أن مختبري الحالي لم يستثمر في هذا الخيار بغض النظر عن عدد المرات التي بكيت فيها) ولكن إذا كان بإمكان جهاز PCR الخاص بك القيام بالتدرج أو اللمس: تعلم كيفية استخدامها ، فسوف ينقذ حياتك.

تضمين التغريدة
هل يمكنك مشاركة البرنامج الذي استخدمته بعد ذلك لتشغيل البرايمر؟ لم أنتهك أبدًا الاختلاف 2 deg الموصي به ، حتى عندما كان لدي بعض التسلسلات المروعة جدًا أيضًا (لكني أعمل على قوالب GC٪ غير المتطرفة) ، لذا فإن رؤية نهج مختلف سيكون أمرًا مثيرًا للاهتمام. شكرا.

سأقوم هنا بنشر بروتوكول Phusion بالكامل الذي أستخدمه من mastermix إلى agarose gel:
1. إعداد الخليط الرئيسي لـ PCR في أنبوب 0.2 مل على الجليد وفقًا للجدول
أدناه. قم بإذابة جميع المكونات غير الإنزيمية في RT ، واخلطها بواسطة دوامة قصيرة واجمعها
بواسطة الطرد المركزي القصير.
العقل المدبر:
(75 ميكرولتر مقسم إلى 6 × 12.5 ميكرولتر)
قالب بلازميد
(التسلسل أو العمود الصف
تحضير البلازميد)
x & muL (قالب بلازميد 5 نانوغرام / 1 كيلوبايت)
-ميليق H2O
(جودة PCR = تعقيمها في زجاجة تم شطفها عدة مرات باستخدام MilliQ لأنك لا تعرف أبدًا من صنع محلول الملح Mn / Mg في تلك الزجاجة قبل أن أحصل على زجاجة يمكنني الوثوق بها ، فأنا دائمًا أعيد استخدام الزجاجة نفسها لإعداد PCR الماء طوال الوقت)
47.75 & muL - x & muL من قالب البلازميد
-5x HF عازلة 15 & ميول
(1x النهائي)
-X_fwd التمهيدي
(5 ميكرومتر)
6 ميكرولتر
(400 نانومتر النهائي)
-X_rev التمهيدي
(5 ميكرومتر)
6 ميكرولتر
(400 نانومتر النهائي)
-dNTP- مزيج
(10 ملم لكل منهما)
1.5 ميليلتر
(نهائي 0.2 ملي كل نيوكليوتيد)
-الرغبة
(2 U / & muL)
0.75 ميكرولتر
(نهائي 0.02 U / & muL)

2. قسّم المزيج الرئيسي إلى 6x 12.5 & muL وقم بتشغيل جميع العينات في دورة PCR باستخدام
تدرج درجة حرارة 10 درجة مئوية (استخدم الأعمدة: 1 ، 4 ، 6 ، 7 ، 9 ، 12 استخدم cycler
قائمة الخيار لحساب درجات الحرارة المقابلة). (هذا لجهاز Eppendorf PCR ، وهو واحد لـ 96 عينة مع التدرج المتضمن ، تحقق من كيفية عمل جهازك الخاص)

برنامج PCR (& # 39 & # 39 يعني ثانية و & # 39 يعني دقيقة):
(20 دورة 105 درجة مئوية (تعمل أيضًا مع غطاء مسخن 99 درجة مئوية) وضبطها على "إيقاف مؤقت")
معرف & ndash تمسخ أولي 30 & rsquo & rsquo 98 & degC
D & ndash deraturation 5 & rsquo & rsquo 98 & degC
& ndash التلدين 15 & rsquo & rsquo = أعلى Tm لكلا البادرين + 5 درجة مئوية
التدرج +/- 5 درجة مئوية
المس لأسفل -0.7 درجة مئوية / دورة
(حساب Tm لتسلسل المطابقة)
http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/Default.aspx
E & ndash extension 15 & rsquo & rsquo / 1 kb 72 & degC
ارجع إلى الخطوة 2 وكرر 13 مرة
D & ndash deraturation 5 & rsquo & rsquo 98 & degC
& ndash التلدين 15 & rsquo & rsquo = انخفاض Tm لكلا البادئين
(حساب Tm للتسلسل الكامل)
http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/Default.aspx
E & ndash extension 15 & rsquo & rsquo / 1 kb 72 & degC
التمديد النهائي FE & ndash 3 & rsquo 72 & degC ارجع إلى الخطوة 5 وكرر 5 مرات
تخزين S & ndash 8 & degC
3. قم بتحميل جميع العينات على 0.8٪ SB agarose-gel (7.5 فولت / سم 40 دقيقة) (بالنسبة لي ، فإن المخزن المؤقت SB لتشغيل agaroses هو المخزن المؤقت المثالي ، يعتبر TAE مخزنًا مؤقتًا قديمًا تم تطويره لأنهم لم يعرفوا أفضل من Tris في تلك الأوقات .. لكن هذه قصة مختلفة تمامًا ، تحقق من درجة حرارة التلدين المثالية بين عيناتك الست وكرر تفاعل البوليميراز المتسلسل مع درجة الحرارة هذه إذا كانت هناك حاجة إلى المزيد من المنتج.

راجع للشغل: عند تكرار PCR ، لا تستخدم أبدًا أكثر من 20 uL لكل 200 أنبوب uL.

وهذا ما يسمى Phusion- لا يفشل أبدًا PCR وقد تم تطويره بواسطة مشرفي أثناء أطروحة الماجستير ، الدكتور ألكساندر شينك. استمتع بك PCRs

ملاحظة قليلة: نظرًا لأنه في مختبري الحالي لا أمتلك آلة PCR متدرجة ، فقد تخطيت التدرج ولا يزال يعمل فقط باستخدام درجات الحرارة المتوسطة كما هو موضح في البروتوكول. لا يزال جهاز PCR الخاص بي لم يفشل أبدًا :)


لماذا يجب عليك استخدام درجة حرارة التلدين حوالي 5 درجات مئوية أقل من Tm من البادئات الخاصة بك؟ - مادة الاحياء

أعطني P! P! أعطني C! ج! أعطني R! ص! ماذا تحصل؟ الكثير والكثير من نسخ الحمض النووي! أنا أحب البروتينات - لذا أتحدث كثيرًا عن هذه & - ولكن للوصول إلى البروتينات ، فأنت بحاجة إلى دليل إرشادي ، لذا يجب توفير الحمض النووي. كل ذلك على متن قطار DNA Pol ، مع دليل بقاء PCR (تفاعل البوليميراز المتسلسل) لملء عقلك! PCR هي تقنية أساسية أخرى أصبحت & rsquos ضرورية للكيمياء الحيوية الحديثة (وحتى الطب الحديث!) فهي تتيح لنا عمل نسخ كثيرة من مناطق معينة من الحمض النووي مما يسمح لنا بالنظر عن كثب والإجابة على أسئلة مثل: & ldquohow هل ضفدع مرتبط بكلب؟ ، & rdquo & ldquois ، هناك طفرة في هذا الجين تسبب هذا المرض؟ ، & rdquo و & ldquois هذا الجين الفيروسي موجود ، مما يشير إلى الإصابة؟ البروتينات التي نريدها! فكيف يعمل؟ (وكيفية جعله يعمل إذا كان لا يريد & rsquot & hellip)

تعليمات صنع البروتينات (سلاسل طويلة من أحرف الأحماض الأمينية التي تنثني إلى أشكال باردة وتعمل كعاملين جزيئيين) مكتوبة بلغة بيوكيميائية مختلفة و ndash DNA. يُطلق على امتدادات الحمض النووي التي تحمل وصفات ldquoprotein & rdquo اسم & ldquogenes & rdquo ، وبما أن الشفرة الوراثية عالمية ، يمكنك لصق هذا الجين بخلية & ldquoany & rdquo وأن الخلية و rsquos ribosomes (آلات صنع البروتين) ستفهم & rdquo وتصنع البروتين المقابل. وبالمثل ، إذا كنت تعرف الجينات التي يمتلكها الكائن الحي (بما في ذلك الشخص) ، فيمكنك معرفة البروتينات التي يصنعونها ، وما إذا كانت تحتوي على نسخ متحولة من بعض الجينات ، وكيف ترتبط بالكائنات الحية الأخرى.

لذا ، فإن DNA & rsquos مهمان حقًا ونوعًا ما يعجبك كيف تحب طاولة ايكيا الخاصة بك ولكن لا تملك ولعًا خاصًا بدليل التعليمات ، لكنك بحاجة إليه ، من أجل فهم البروتينات بشكل أفضل ، غالبًا ما يتعين علي التعامل مع تعليمات الحمض النووي الخاصة بهم ، والقيام بذلك هذا أنا بحاجة لعمل نسخ كثيرة من امتدادات معينة من الحمض النووي ، والحمد لله يوفر PCR طريقة! يُعزى اكتشاف PCR إلى Karry Mullis (الذي يعمل لصالح شركة تكنولوجيا حيوية تسمى Cetus Corporation) الذي حصل على أول بصيص منه في عام 1983 ونشره كأسلوب شرعي في عام 1985 (وفي عام 1993 فاز بجائزة نوبل عن ذلك).

كما هو الحال مع جميع الاكتشافات العلمية & ldquobreakthrough & rdquo ، لم يكن بإمكانه فعل ذلك مع عمل عدد لا يحصى من العلماء الآخرين الذين عملوا قبله. (ولم نتمكن من القيام بالعمل الذي نقوم به اليوم بدون عمل هو والآخرين!).

على سبيل المثال ، تم إعداد المسرح جزئيًا بواسطة Arthur Kornberg ، الذي فاز بجائزة نوبل لاكتشافه إنزيمًا (سرعة رد الفعل الأعلى) يمكنه نسخ الحمض النووي ، باستخدام خيط واحد من أحرف الحمض النووي (deoxynucleotides (dNTs)) كنموذج لـ ربط (البلمرة) والحروف المتقابلة و rdquo في سلسلة تكميلية (والتي يمكن استخدامها بعد ذلك كقالب لإعادة إنشاء تسلسل القالب الأصلي هذا بفضل 1: 1 & ldquooppositeness & rdquo من أحرف DNA (المزيد أدناه). أطلق على هذا الإنزيم DNA Polymerase (DNA Pol ) ويمكنه الحصول عليها لعمل نسخ تكميلية واحدة من الحمض النووي ، لكن مساهمة موليس و [رسقوو] كانت تستخدم هذا الحمض النووي بول لعمل الكثير والكثير من النسخ.

وما زلنا نفعل. لكننا نستخدم عادةً نسخًا شديدة الصلابة من DNA Pol يمكنها تحمل درجات الحرارة العالية التي نديرها خلال العملية التي سأخبرك بها. وهذا الاختيار للبوليميراز هو مجرد قرار واحد عليك (أعني أن تفعله) عندما تذهب إلى آلة نسخ الحمض النووي! لذلك نأمل أن يساعدك اليوم & rsquos post على تسوية روتينك. سأبدأ بنظرة عامة حول كيفية عملها (لذا آمل ألا تكون شديدة اللهجة / متزعزعة) ولكن بعد ذلك سأدخل في بعض التفاصيل لمن يريدها. (نعتذر مقدمًا عن التنسيق & ndash طالب الدراسات العليا بدوام كامل يقوم بأشياء معملية بدوام كامل & hellip) لذا دع & rsquos تذهب!

DNA (DeoxyriboNucleic Acid) هي اللغة الكيميائية الحيوية لدينا معلومات وراثية و rsquos مكتوبة بأبجديتها وتتكون من 4 deoxynucleotide (dNT) و ldquoletters ، & rdquo A ، T ، C ، & amp G التي تحتوي على & ldquogeneric & rdquo جزء مكون من سكر deoxyribose مع الفوسفات (s) ) موصولة على الذراع & ldquoleft & rdquo (5 & rsquo الموضع) بها مجموعة هيدروكسيل (-OH) مثل a & ldquoleft leg & rdquo (3 & rsquo position) & amp ثم الحروف المختلفة لها قواعد مختلفة & ldquonitrogenous & rdquo (القواعد) التي تلتصق كذراع & ldquoright & rdash الأجزاء ذات الحلقة المفردة أو المزدوجة.

تستخدم dNTs أجزائها العامة للربط معًا من خلال روابط phosphodiester لتشكيل الحمض النووي الطويل الذي تقطعت به السبل (ssDNA) و 2 خيوط مفردة تكميلية و ldquozip معًا و rdquo باستخدام أجزائها الأساسية الفريدة (A عبر من T ، C عبر من G) لتشكيل DNA مزدوج تقطعت بهم السبل ( dsDNA). يحمي هذا التجويف المزدوج من التلف (تواجه القواعد في) ويسمح بنسخه بسهولة لأنه إذا قمت بفك ضغطه ، يمكن استخدام خيط واحد كقالب لعمل آخر.

هذا & ldquounzip and copy & rdquo هو ما يحدث في التكرار و ndash قبل أن تنقسم الخلية ، تحتاج إلى نسخ كل حمضها النووي (الجينوم بأكمله) حتى تتمكن من تمرير مجموعة كاملة إلى كل خلية ابنة ، وهي تفعل ذلك بمساعدة الحمض النووي Pol ، الذي يجمع بين النيوكليوتيدات التي تتجول بحرية ، ويجمع العناصر الصحيحة معًا ويساعدها على الارتباط ، بينما يرفض العناصر الخاطئة (تلك التي لا تكمل بعضها البعض (على سبيل المثال ، don & rsquot let a bind a C!)

PCR (تفاعل البوليميراز المتسلسل) هو وسيلة لتنفيذ هذه العملية في أنبوب اختبار (صغير جدًا) ونسخ جزء صغير فقط من الحمض النووي ، والذي نحدده باستخدام PRIMERS. الاشعال عبارة عن قطع قصيرة من الحمض النووي (oligonucleotides ، أو & ldquooligos & rdquo) والتي نصممها لـ & ldquobookend & rdquo منطقتنا (AMPLICON). لذلك ، لكل تفاعل نقوم بتصميم وطلب مواد أولية مختلفة (لحسن الحظ أنها & rsquore رخيصة!)

نحن بحاجة إلى هذه المواد الأولية لأن DNA Pol يمكن أن تبدأ في بناء سلسلة من نقطة الصفر ويجب أن تبدأ من امتداد قصير مزدوج الشريطة. هذا مجرد أحد حدوده (ولكن في بعض الأحيان يمكن أن تكون القيود جيدة! أنت لا تريد أن تنسخ الخلايا DNA بشكل عشوائي!) أحد القيود الأخرى هو أنه يمكن فقط نسخ الحمض النووي في اتجاه واحد (5 & rsquot إلى 3 & rsquo). قبل أن نبتعد كثيرًا ، دع & rsquos نتأكد من أننا & rsquore NSYNC & hellip (فتاة التسعينيات ، آسف!)

ربط الحروف هو & ldquogeneric & rdquo لأنه يتضمن فقط الأجزاء & ldquobackbone & rdquo التي تحتوي عليها جميع الأحرف (روابط phosphodiester تتضمن دمج الفوسفات و amp hydroxyl) حتى تتمكن من ربط الأحرف بأي ترتيب (مثل ATTACA أو CAAATT). لكن حبلا zipping محدد لأنه يحدث من خلال تفاعلات القواعد الفريدة. لذا فإن & ldquo المقابل & rdquo لـ ATTACA هو TAATGA ، والذي يختلف عن GTTTAA. لكن كتابة الأضداد بهذه الطريقة مضللة بعض الشيء لأن الاتجاه المعاكس يجب أن تقرأه.

إذا كان لديك ATTACA ، وقمت بلصق الأحرف التكميلية المقابلة له ، فستحصل على هذا:

BUT & ndash dsDNA هو ANTIPARALLEL & ndash وهذا يعني أن الخيوط تعمل في اتجاهين متعاكسين (أحدهما 5 & rsquo- & gt3 & rsquo والآخر هو 3 & rsquo- & gt5 & rsquo مع & lsquo واضحًا & ldquoprime & rdquo ويشير إلى ما إذا كان الذراع الأيسر & ldquool (5 & rdquo) أو لهذه الغاية & rsquos sugar مجاني). وبالتالي

وعادة ما نكتب التسلسلات 5 & rsquo إلى 3 & rsquo ، لذا فإن التسلسل & ldquocomplimentary & rdquo إلى 5 & rsquo ATTACA 3 & rsquo هو 5 & rsquo AGTAAT 3 & rsquo

قد يبدو هذا مجرد تقنية ، لكنه & rsquos مهم حقًا في الواقع! نظرًا لأن DNA Pol يمكنه فقط نسخ الحمض النووي في اتجاه واحد ، 5 & rsquo إلى 3 & rsquo ، وعليك دائمًا أن تضع في اعتبارك الطريقة التي تعمل بها مسارات ldquotrain & rdquo

مسارات القطار؟ هذا تشبيه غريب آخر لي & ndash أحب أن أفكر في النيوكليوتيدات كمسارات قطار و DNA Pol كقطار. لا يمكن لهذا القطار السفر إلا على مسار مزدوج تقطعت به السبل ، لذلك يتعين عليه وضع المسار أمامه أثناء سيره (ويعرف المسار الذي يجب وضعه من خلال جعله & ldquomatch & rdquo على الجانب الآخر من المسار (على سبيل المثال ، إذا كان المسار التالي على الجانب الآخر منه (على الشريط الآخر) يوجد حرف T ، وضع حرف A). في PCR ، توفر البادئات محطات انطلاق للقطار (نظرًا لأن DNA Pol يحتاج إلى تقطعت بهم السبل للبدء ، فإنه يبدأ فقط من حيث تجعله مزدوجًا تقطعت به السبل (ولكن أقصر من الشريط الآخر ، لذا لا يزال هناك & rsquos أشياء لنسخها. بشكل أساسي ، تريد شيئًا مثل هذا:

يتم تشغيل PCR في دورات من 1 & # 65039 & # 8419 MELT (تسخين dsDNA لفك ضغط الخيوط) 2 & # 65039 & # 8419 ANNEAL (يبرد قليلاً للسماح للبرايمر بالترابط و 3 & # 65039 & # 8419 EXTEND (بدءًا من حيث يترك التمهيدي ، أضف نيوكليوتيدات مكملة لجدلا القالب حتى تصل إلى نهاية حبلا القالب). بعد الدورة الأولى (حيث يذهب بول حتى نفاد البخار أو ينفد الوقت) ، يتم تحديد هذه النهاية بواسطة برايمر و rsquos آخر لأن الحمض النووي يمكنه فقط نسخه * لا يمكن & ldquocompose & rdquo لذا فإنه & rsquoll يجري خارج المسار المقابل للموضع الذي بدأ نسخ الشريط منه في الجولة الأولى. (أسهل الشرح في الصور)

يمكنك القيام بذلك أكثر من & amp ؛ # 128257 (30 مرة أو نحو ذلك) للحصول على الكثير من النسخ (في كل مرة تحصل على 2X عدد النسخ لأن كل حبلا جديد يصبح حبلا قالب آخر).

قد يبدو وكأنه طن من العمل & ndash وبالنسبة للجزيئات هو كذلك! & - لكن بالنسبة لنا ، بمجرد إعداد رد الفعل ، فإن الجزء الأصعب هو انتظار انتهاءه! ليس لـ Mullis ، ومع ذلك & hellip It & rsquos & ldquoeasy & rdquo هذه الأيام لأن لدينا آلات تسمى cyclers الحرارية التي تقوم بالتسخين والتبريد والتدفئة والتبريد والتدفئة والتبريد السريع

لكن هذه الآلات لم تظهر على الساحة حتى عام 1987 (وبالطبع لم يكن بمقدور كل مختبر تحمل تكلفتها ، وما إلى ذلك) لذلك في البداية كان العلماء ينقلون أنابيب التفاعل يدويًا من حمام مائي إلى آخر مرارًا وتكرارًا.

رد الفعل لربط النيوكليوتيدات معًا (بلمرة النوكليوتيدات) هو نفسه بغض النظر عما إذا كان يحدث في خلاياك أو في الأنبوب. إنه & rsquos أيضًا هو نفسه بالنسبة إلى RNA (ولكن باستخدام Pol مختلف). ولكن هنا نحن & rsquoll نتحدث بمصطلحات الحمض النووي. لذا فإن التفاعل يأخذ مجموعتين من ديوكسينوكليوتيد ثلاثي الفوسفات (dNTPs) (تحتوي على 3 مجموعات فوسفات (PO & # 8324 & sup3 & # 8315) مرتبطة ببعضها البعض) وتربطها معًا. وعندما تفعل ذلك ، فإنها تطلق 2 من تلك الفوسفات كجزيء بيروفوسفات (PPi)

لذلك ، نفس العملية و ldquoin vivo & rdquo (في الجسم) و ldquoin vitro & rdquo (في بيئة اصطناعية مثل أنبوب الاختبار) ، ولكن في الخلايا يوجد الكثير من المساعدين ، بينما في PCR يتم تجريد العملية إلى ضرورياتها العارية:

& # 128313 DNATEMPLATE: يحتوي dsDNA على التسلسل الذي تريد نسخه (تضخيمه)

& # 128313PRIMERS: قصير ssDNA يكمل نهايات amplicon (1 ليكون بمثابة موقع بدء لكل حبلا)

& # 128313dNTPS: ستتم إضافة كتل بناء نيوكليوتيد (أحرف)

& # 128313BUFFER: مزيج سائل من الأملاح ومثبتات درجة الحموضة للحفاظ على كل شيء سعيدًا

& # 128313Mg & sup2 & # 8314: كاتيون المغنيسيوم (& # 10133 جزيء مشحون) ليكون بمثابة & ldquochaperones & rdquo للمساعدة في حماية الفوسفات وشحن 10134

غالبًا ما يكون أحد أصعب أجزاء إجراء تفاعل كيميائي حيوي هو تجميع المواد المتفاعلة معًا وإبقائها معًا لفترة كافية للتفاعل. لماذا & rsquos هذا صعب جدا؟ تحب الجزيئات أن تكون حرة في التحرك (فهي تريد نسبة عالية من ENTROPY) ولا تحب أن تكون مقيدة. يشير Entropy إلى عدد & ldquostates & rdquo المختلفة التي يمكن أن يكون فيها الجزيء (يمكن أن يشير هذا إلى التواجد في أماكن مختلفة أو بأشكال مختلفة قليلاً (على سبيل المثال ، تم تدوير السندات قليلاً). من المحتمل أن تعرف مكانهم بالضبط في أي وقت.

يشبه الحصول على النيوكليوتيدات للارتباط ، الحصول على مجموعة من الأطفال يركضون في الاستراحة ليشكلوا سباقًا طويلًا ثلاثي الأرجل. أولاً ، عليك أن تجعلهم يأتون ، ثم عليك أن تجعلهم يظلون لفترة طويلة بما يكفي لإقناعهم بالارتباط ، وبعد ذلك بمجرد ربطهم ، عليك أن تجعلهم & ldquofun & rdquo لهم على الرغم من أنهم يستطيعون & rsquot الركض بعد الآن لأن حركتهم مقيدة بالارتباط بالشخص المجاور لهم. ويواجه بول وقتًا أصعب لأنه يجب أن يجعل الأطفال يتواصلون بترتيب معين!

فكيف يمكن لبروتين صغير أن يفعل كل هذا؟ عن طريق إعطاء النيوكليوتيدات شيئًا ما تريده في المقابل & ndash تخليصها من اثنين من الفوسفات. يلتصق الفوسفات بالطرف 5 & rsquo ، ويقومون بتركيز الشحنات السالبة المركزة معًا مثل الزنبرك. يحتوي PHOSPHATE (PO & # 8324 & sup3 & # 8315) على ذرة فوسفور مركزية (P) متصلة بأربع ذرات أكسجين (O). تحتوي على إلكترونات & ldquoextra & rdquo (e & # 8315) لذا فهي مشحونة & rsquos & # 10134. تتنافر الشحنات ، لذا لا يحب الفوسفات أن يكون بجوار بعضه البعض. لذلك يتطلب الأمر جهدًا (على شكل طاقة (E)) لتجميع الفوسفات معًا (مثل ضغط الربيع) وندش ، لذلك نسمي هذه الروابط & ldquohigh energy & rdquo وعندما يتفككون أن E & rsquos تم تحريرها لاستخدامها في أشياء أخرى مثل الدفع تكلفة ربط النيوكليوتيدات معًا.

لذلك ، على الرغم من أن بلمرة النوكليوتيدات لا تزال مكلفة للغاية لأنك تقوم بربط الجزيئات ، & # 11015 & # 65039 حريتها (& # 11015 & # 65039 إنتروبيا) ، يتم تعويض هذا عن طريق & # 11014 & # 65039 في الانتروبيا التي تحدث عند PPi تم إطلاقه وتحلله بالماء (مقسومًا بالماء) ليمنحك عنصرين من الفوسفات الفردي (Pi) (وكيئين صغيرين يتحركان بحرية أكبر من الشيء المتوسط ​​الصغير (PPi) الذي تم إطلاقه في البداية & ndash حتى تحصل على ضعف- تعزيز

ولكن من أجل الحصول على هذه الميزة ، تحتاج أولاً إلى جعلهم يتفاعلون ، وغالبًا ما يكون هذا هو المكان الذي تدخل فيه البروتينات و / أو كاتاليستس (تسريع التفاعل) المسماة ENZYMES. فهي تعمل كنوع من & ldquomediator & rdquo تجمع المتفاعلات الصحيحة معًا ، وعقدهم في المواقف المثلى للرد ، واستقرار وسيطة التفاعل. & أمبير ؛ توفير بيئة ودية.

كما ذكرت من قبل ، اكتشف آرثر كورنبرغ بعض الإنزيمات التي تساعد في التوسط في نسخ الحمض النووي: بوليمرات الحمض النووي (DNA Pols). يساعد DNA Pol في الاحتفاظ بنكليوتيد وارد (من صنف ثلاثي الفوسفات) بالقرب من السلسلة المتنامية التي يجب إضافتها إلى & amp في الموضع الصحيح. ثم تدخل مجموعة 3 & rsquo hydroxyl (OH) للهجوم! إنه يلتصق بالمجموعة الأولى من الفوسفور (P) من النوكليوتيدات الواردة - & gt أن P لديها الآن الكثير من الروابط ، لذلك فهي تطلق مجموعتي الفوسفات الأخريين مثل جزيء الفوسفات غير العضوي PYROPHOSPHATE (PPi) (تعزيز الطاقة 1). ثم يتم تحلل بيروفوسفات (تكسير بإضافة الماء) إلى جزيئين من ORTHOPHOSPHATE (Pi) (تعزيز الطاقة 2).

تمتلك DNA Pols هذه الآلية العامة بشكل مشترك ، ولكن الكائنات الحية المختلفة لها نقط مختلفة قليلاً من الحمض النووي التي تختلف في الكفاءة ، والعملية ، والإخلاص ، والحساسية الحرارية.

  • الكفاءة: ما مدى السرعة التي يمكن أن تسير بها؟
  • العملية: كم عدد النيوكليوتيدات التي يمكن أن تضيفها قبل أن تسقط من القالب؟
  • فيديليتي: كم عدد الأخطاء المطبعية التي تحدث؟
  • الحساسية للحرارة: ما مقدار الحرارة التي يمكن أن يستغرقها؟

يمكنك الحصول على FIDELITY أعلى (عدد أقل من الأخطاء المطبعية) إذا كان Pol الخاص بك يحتوي على نطاق & ldquoproofreading & rdquo 3 & prime & rarr 5 & Prime exonuclease (DNA end-chewing) يمكن أن يستشعر الأخطاء ، & ldquobackspace & rdquo لإزالتها ، ثم ضع الحرف الصحيح. يعد هذا الإجراء مهمًا لأنه سيتم نسخ الأخطاء ونسخ hellip & amp ونسخ hellip & amp ونسخ hellip ولكنه يبطئ العملية حتى تحصل على كفاءة أقل.

يمكن أن تساعد أيضًا أجزاء أخرى من بروتينات DNA Pol. طريقة لزيادة الكفاءة هي عن طريق زيادة PROCESSIVITY & ndash ابق Pol على القالب. من المؤكد أن السقوط المستمر والقفز مرة أخرى يؤدي إلى إبطائك! المجالات المعززة للعملية (a & ldquodomain & rdquo هو مجرد بروتين & ldquosection & rdquo) أو منفصل معزز للمعالجة ووحدات ldquosubunits و rdquo ربط dsDNA للمساعدة في تثبيت Pol. لكن الأهم من ذلك أنهم لا يقومون بربط & rsquot & ldquotoo بإحكام & rdquo & amp ؛ يمكنهم ربط أي تسلسل & ndash يسمح هذا لـ Pol بالبقاء ولكن الانزلاق على طول

ولكن قبل أن تتمكن من نسخ الخيوط ، يجب عليك فك ضغطها ، وهذا أيضًا مكلف للغاية (مثل تقشير قطعتين من الشريط اللاصق معًا). عليك أن تضع الطاقة لإعطاء جزيئات الحمض النووي المزيد من الطاقة حتى تتذبذب أكثر وتتفكك الخيوط.

في خلاياك ، تساعد مساعدي الإنزيم المسماة HELICASES في فك ضغطها باستخدام الطاقة الكيميائية من ATP ، لكن إصدارنا من & ldquobare-bones & rdquo PCR لا يحتوي على هؤلاء المساعدين. بدلاً من ذلك ، نحصل على الطاقة اللازمة من الحرارة. في خطوة MELT ، نقوم بتسخين dsDNA فعليًا حتى تتفكك الخيوط. وعلينا أن نجعلها ساخنة حقًا! (

95 درجة مئوية أو 200 درجة فهرنهايت). Human DNA Pol would be pretty useless at this temp bc same heat that causes strands of DNA to come apart (yay!) can also cause proteins to unfold (eek!) (just like chains remain chains when you melt DNA (you don&rsquot break up strong covalent bonds), heat denaturation of proteins leaves you w/chains of amino acids)

Thankfully there are organisms called THERMOPHILES that have evolved to live in super hot environments (like near thermal vents in the ocean). They have super-strong proteins that can withstand high temps needed PCR. The &ldquoclassic&rdquo PCR Pol is Taq, which was discovered in 1976 and gets its name because it comes from the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. Taq really made PCR possible &ndash before that, scientists trying to copy DNA in the lab were using a DNA Pol from e. coli bacteria. That DNA Pol couldn&rsquot take the heat, so after each heat step, they&rsquod have to add more! In fact, the first thermal cycler, named &ldquoMr. Cycle&rdquo was designed with an open system so you could keep adding more. https://bit.ly/2FoUFkD

So Taq was a major, crucial, discovery. But it&rsquos definitely not &ldquoperfect&rdquo &ndash Taq tends to make a lot of typos (low FIDELITY). Pfu DNA polymerase (from Pyrococcus furiosus) makes fewer errors (so higher FIDELITY). BUT it has relatively low EFFICIENCY. Could we do better?

It&rsquos hard to get all 4, but that hasn&rsquot stopped scientists from trying! Scientists can stitch together parts they like from different Pols to get Pol &ldquochimeras&rdquo w/enhanced functions. Our lab uses a chimera called Phusion Polymerase (not a paid endorsement, just what we use!) It&rsquos based off of a Pfu-like DNA Pol (w/proofreading capability for increased fidelity) fused to a small dsDNA-binding protein called Sso7 (from Sulfolobus sulfactaricus) which serves as a processivity-enhancing domain. It can add 1000 nucleotides (1 kb) in only 15 seconds w/few errors! So we time out the extension step accordingly (e.g. if we want to copy a 4kb segment, we&rsquoll set the extension step for 4×15=60s

So, DNA Pol was one choice we need to make, but there are others too&hellip.

Where what do you want your start & stop sites to be? Design primers to match &ndash but not just any sequence&hellip It&rsquos really important to design the stations (primers) carefully. Like many things in biochemistry, it&rsquos largely a matter of AFFINITY & SPECIFICITY

SPECIFICITY. We want the primers to bind ONLY where we want them to bind. Say you ask some friends to buy you a train ticket for a trip from Kansas City to NYC Is that Kansas City, Kansas? Or Kansas City, Missouri? Some friends might think Kansas, others might think Missouri & you end up with 2 types of train tickets..

Similarly, if your primer can bind at multiple sites on the DNA, you end up copying different stretches of train track giving you a mix of &ldquononspecific products&rdquo which show up as multiple bands on an agarose gel you use to separate the DNA pieces by size & visualize them: http://bit.ly/agarosegelrunning

When you design primers, you want to make sure they match your site of interest & ONLY that site. Like a computer password, the longer the sequence, the more likely it is to be &ldquounique.&rdquo If there are multiple occurrences of sequence you initially choose you might have to lengthen it to include more of the surrounding sequence (like saying &ldquofind a blue house w/a red house on the left & a green house on the right&rdquo instead of just saying &ldquofind a blue house&rdquo) You can use free software programs like NCBI BLAST or Primer3 to help you check for specificity & design good primers

BUT too long a primer and you can face other problems that lead to a &ldquoPCR TLDR&rdquo (too long didn&rsquot read)&hellip

🔹 PRIMER DIMERS: this is where the primer binds to itself instead of to your template. These can be self-dimers (where 2 &ldquostart stations&rdquo or &ldquostop stations&rdquo bind to themselves or cross dimers (a start & a stop)

🔹SECONDARY STRUCTURE: a single primer can fold up into &ldquohairpins&rdquo & bind itself

This leads to less primer available to bind template, so lower yield (less copies made) & DNA Pol can end up using primers as a (really short) template, amplifying primer &ldquoartifacts&rdquo instead of desired amplicon. And the high primer concentrations needed to prevent template-template zipping, make such primer pairing more likely because there are more primer fish & fewer template fish in the sea

Secondary structure in the *template* can also be a problem &ndash some regions of DNA are tightly wound up, making it hard to get to the site to bind (it&rsquos hard to build a train station in the middle of a mountain pass). You also want to avoid repetitive stretches (things like &ldquoAAAAAA&rdquo) because it makes it easier to &ldquoslip&rdquo & misprime

Typical primers are usually

20 nucleotides (nt) long, but it depends on experiment type, etc. There&rsquos free software available (like NCBI Primer-BLAST, Primer3, & AmplifiX) to help you design primers to fit your needs.

AFFINITY: We want the primers to have high affinity (attractiveness & stickiness) for the site we want them to bind so that they&rsquoll bind there stably & not fall off randomly during the annealing or extension steps. BUT we don&rsquot want the affinity to be too high or it won&rsquot come off during the melt steps

Affinity is largely dependent on the primer length (longer primers have more interstrand bonds working together to keep the strands glued shut) & &ldquobase composition,&rdquo When G&rsquos & C&rsquos are across from each other they can form 3 H-bonds. But when A&rsquos & T&rsquos are across from each other they can only form 2 H-bonds, so G-C pairs are stronger than A-T pairs. So a higher &ldquoG-C&rdquo content (typically given as a % of bases) means stronger binding. Ideal is usually

note: this is why origins of replication (ORIs) (where DNA strands come apart to be copied before cells divide) tend to be &ldquoA-T rich&rdquo because it makes it easier to melt them apart

Just like it&rsquos easier to pull off a piece of tape from the end than the middle, it&rsquos easier to pull of primers from the end, so you might want to put a&ldquoG-C&rdquo clamp at the 3&rsquo end (1 C or G) to help latch it on tight

A common measure used to calculate/report this affinity is the Tm (melting temperature). It&rsquos the temperature at which 1/2 the primer is bound &ndash the higher the temp, the more energy the molecules have & the harder it is to get the DNA to &ldquostay still&rdquo & bind. A high Tm means the affinity&rsquos high enough to hold down the wriggling DNA. Sp higher Tm, higher affinity. You typically want

60°C & you want the Tm of the 2 primers to be similar to one another (within

You want to know these Tms because they&rsquoll help you decide what temp to use for your annealing temperature &ndash they temperature you program the thermal cycler to be at during the primer-binding step of each cycle.

How do decide? The higher the temp, the more energy the DNA molecules have so it&rsquos harder for them to be &ldquotied down.&rdquo At higher temps, they have to really like their binding partner in order to sacrifice the freedom to move freely. But at lower temps, they have less energy, so they&rsquore less &ldquopicky&rdquo & more likely to &ldquosettle&rdquo for less-optimal pairing. As a result, if the annealing temp is too low, your primers can &ldquomisprime&rdquo & bind at the wrong sites giving you a mixture of &ldquononspecific&rdquo products.

So you want to choose a Goldilocks ANNEALING TEMPERATURE where the DNA molecules have enough energy to seek out their soulmate, BUT not so much that they can&rsquot &ldquotie the knot&rdquo once they find it. To help you choose, you can use free software to calculate the melting temperature (Tm) of the primers based on their length & sequence (since G&rsquos & C&rsquos bind each other more strongly than As & Ts (thanks to their 3rd H-bond), higher GC content increases the Tm. Common annealing temps are

55-80°C, and you want the Tms for both primers to be similar so that they both get to be Goldilocks-happy at the same time.

How long should the extension step be? Basically, each cycle, you need to give DNA Pol enough time to copy the region between the primers. So the optimal time depends on length of the sequence you want copied (AMPLICON SIZE) & the speed (efficiency) of the DNA Pol. The &ldquoclassic&rdquo Taq polymerase (a DNA Pol that can tolerate the high temps required) can add

360nt/min, but &ldquonewer models&rdquo (either from other organisms &/or mutated) like Pfu Turbo can go faster (

1000nt (1kb)/min)) So, for example, if you&rsquore using Pfu Turbo to copy something 2kb long, you&rsquod want to make sure your extension is a little over 2 minutes. هذا هو per cycle so with longer times, be prepared to do some waiting (a great time to pour that agarose gel you&rsquoll use to check that it worked!)

Just how long you&rsquoll have to wait depends on how many cycles you choose. And that depends in part on how many copies you want made (each cycle you increase # of copies exponentially (e.g. 2, 4, 8, 16, 32, 64&hellip), so by 35th cycle you&rsquod have 68 billion copies! You might think, the more the better, right? BUT the more copies you make, the more chance for errors to occur (& be copied) Common cycle #s are

25-30 (but even if you have to wait you don&rsquot have to manually move the tube over and over!)⠀


Why should you use an annealing temperature about 5°C below the Tm of your primers? - مادة الاحياء

Policies For PrimerBank Usage

PrimerBank is a public resource for PCR primers. These primers are designed for gene expression detection or quantification (real-time PCR). There are several ways to search for primers: by GenBank Accession, NCBI protein accession, LocusLink ID, PrimerBank ID or Keyword (gene description). PrimerBank contains about 180,000 primers covering most known human and mouse genes.

Polymerase Chain Reaction Amplification (PCR) is one of the most actively used techniques in molecular biology. In recent years, PCR has been increasingly used for gene expression detection or quantification. It is a more convenient method in gene expression studies comparing to other techniques, such as Northern Blot. One common problem in PCR is the non-specific amplifications of other gene products because cDNAs libraries of thousand of genes are often used as PCR templates. Therefore, we need to carefully design PCR primers that specifically amplify the genes of interest. Unfortunately, most available primer design programs only focus on primer chemical properties, such as melting temperature, GC content, secondary structure, etc. Little emphasis is given to primer mispriming to other genes. In contrast, all primers in PrimerBank were carefully designed to ensure gene specificity.

The primer design algorithm has been extensively tested by real-time PCR experiments for PCR specificity and efficiency. We have tested 26,855 primer pairs that correspond to 27,681 mouse genes by Real Time PCR followed by agarose gel electrophoresis and sequencing of the PCR products. The design success rate is 82.6% (22,187 successful primer pairs) based on agarose gel electrophoresis.

You may search PrimerBank by GenBank Accession, NCBI protein accession, LocusLink ID, NCBI gene symbol or PrimerBank ID.

Search terms are automatically combined if they are separated by space. For example, search "kinase s6" returns all records with both keywords "kinase" AND "s6". AND and OR Boolean operators may also be used. وفيما يلي بعض الأمثلة على ذلك:

الكلمة الرئيسية Interpretation
kinase s6 Searching for both kinase and s6
kinase and s6 Searching for both kinase and s6
Cytochrome or cyp Searching for either Cytochrome or cyp

Currently, only a limited set of keywords (keywords defined in the protein definitions) can be searched. For example, you cannot search by gene symbols. If you did not find your genes, please look up the corresponding gene IDs (DNA accessions, proteins accessions, or LocusLink IDs) and search by IDs.

Because of the sequence redundancy in GenBank, each gene is usually represented by more than one NCBI record. PrimerBank sometimes uses the NCBI LocusLink index file to map multiple sequence records to the same gene locus. As a result, a different accession number other than originally submitted may be retrieved. However, both accessions represent the same gene. If a retrieved record has a different GenBank accession, a LocuLink ID will appear in the gene description field.

You may use your browser's save function to save the web page in your local computer. Other saving options will be implemented later.

All the primers in PrimerBank were designed using a program called uPrimer. Great care has been given to avoid primer mispriming to other known genes in a genome. Here is a list of criteria for gene specific primer design:

  1. The primer length range: 19 - 23 nt, with the optimal length at 21 nt.
  2. The primer GC percentage range: 35% - 65%.
  3. The delta G value for the five 3&rsquo end-bases is at least -9 kcal/mol.
  4. The primer Tm range: 60 - 63 °C, determined by the Nearest Neighbor Method.
  5. The PCR product length range is 100 - 250 bp. If this requirement cannot be satisfied, alternative ranges will be used.
  6. The default number of primer pairs designed for each sequence is 3.
  7. No primer is designed from low-complexity regions.
  8. A primer does not contain 6 or more contiguous same nucleotides.
  9. A primer does not contain any ambiguous nucleotide.
  10. No repetitive 15-mer from other gene sequences in the genome (for both strands) anywhere in a primer.
  11. No repetitive 13-mer from non-coding RNA sequences (for both strands) anywhere in a primer.
  12. The global BLAST score for any primer is less than 30 (equivalent to 15-mer perfect match).
  13. The maximum Tm for the 3&rsquo end perfect match to other gene sequences does not exceed 46 °C does not exceed 42 °C when compared to non-coding RNA sequences (Tm determined by the Nearest Neighbor Method).
  14. For primer secondary structure (the primer-primer self-annealing)
    1. No repetitive 5-mer is allowed anywhere when a primer sequence is compared to its complementary strand.
    2. The four 3&rsquo-end bases should be unique when compared to the primer&rsquos complementary strand.
    1. No repetitive 9-mer is allowed when a primer sequence is compared to the complementary strand of its cognate sequence.
    2. The BLAST score is less than 18 when a primer sequence is compared to the complementary strand of its cognate sequence.

    All the primers in PrimerBank have melting temperatures (Tm) of 60 - 63 °C. A higher annealing temperature results in more specific priming. Previous studies indicated sufficient priming should occur at primer Tm. Therefore, an annealing temperature of 60 °C is recommended for all PrimerBank primers. Non-specific PCR products are likely to occur at lower annealing temperature. We have tested a few hundred primers under 60 °C annealing temperature and the PCR experiments worked very well.

    The primer Tm values are calculated using the Nearest Neighbor Method with the up-to-date thermodynamic parameters. Tm values are also dependent on primer and salt concentrations. Higher concentrations of primer and salt usually lead to higher Tm. The Tm values included in PrimerBank are for 0.25 uM primer, 1.5 mM Mg2+, 50 mM Na+, and 0.8 mM dNTP, which are typically used in PCR experiments. Other common PCR conditions only affect the Tm slightly.

    To guarantee PCR efficiency, small PCR products are recommended. Most PrimerBank primers lead to amplicons in the size range of 100 - 250 bp. PCR efficiency is close to 100% in this range (supported by real-time PCR experiments). However, PCR efficiency may be reduced for much larger PCR products. Less than 1% of PrimerBank primers lead to >400 bp amplicons. Please be cautious about PCR efficiency when these primers have to be used.

    Sometimes it is desirable to select a primer pair that spans intron. In this way, genomic DNA contamination can be closely monitored. Usually a PrimerBank primer pair spans intron because a typical exon is quite small. The primer intron-spanning information will be included in the next version update. If it is important for you to be sure that a primer pair spans intron, you may simply do a BLAST search of the primer pair sequences, or better the amplicon sequences (listed in the primer detail page) against the genomic sequences.

    Agarose gel electrophoresis or melting curve analysis may not always reliably reflect PCR specificity. From our experience, bimodal melting curves are occasionally observed for long amplicons even when the PCRs are specific. The observed heterogeneity in melting temperature was due to internal sequence inhomogeneity (e.g. independently melting blocks of high and low GC content) rather than amplicon contamination. On the other hand, for short amplicons very weak bands migrating ahead of the major specific bands are occasionally observed on agarose gel. These weak bands are super-structured or single-stranded version of the specific amplicons in equilibrium state. Although gel electrophoresis or melting curve analysis alone may not be 100% reliable, the combination of both can always reveal PCR specificity in our experience.

    Although all PrimerBank primers are designed to be gene-specific, we still need to be very careful about PCR conditions.

    Non-specific primer extension of only a few bases at low temperature by DNA polymerase can easily lead to non-specific PCR amplifications. Therefore, hot-start PCR is STRONGLY recommended. In fact, I only do hot-start PCR in my experiments. I routinely use AmpliTaq Gold polymerase (Applied Biosystems) for hot-start PCR.

    The annealing temperature may affect PCR specificity. To avoid non-specific PCR products, a high annealing temperature (the smaller one of the two Tm values from the primer pair) and a short annealing time are recommended.

    If you still see non-specific bands, it could mean the primer pair in use is the problem. Although great care has been given to design PrimerBank primers, the success rate is not 100%. Less than 1% of the primers may have design problems (see our paper for detailed discussion). In this case, please try a different primer pair for the same gene. Click here if you would like to report primer problems.

    Poor quality of PCR templates, primers, or reagents may lead to PCR failures. First, please include appropriate controls to eliminate these possibilities.

    Some genes are expressed only in certain tissues. Please first read literature to make sure your genes are included in the cDNA templates. In our experience, this is the most likely cause for negative PCR results. If you are sure the genes are expressed, then try lowering the annealing temperature (to Tm - 5 °C) and increasing the annealing time to ensure sufficient primer annealing.

    If you still could not see any PCR band, it could mean the primer pair in use is the problem. Although great care has been given to design PrimerBank primers, the success rate is not 100%. Less than 1% of the primers may have design problems (see our paper for detailed discussion). In this case, please try a different primer pair for the same gene. Click here if you would like to report primer problems.

    The algorithm and initial testing of PrimerBank were generated by Wang and Seed, Xiaowei Wang and Brian Seed (2003) A PCR primer bank for quantitative gene expression analysis. Nucleic Acids Research 31(24): e154 pp.1-8. and further refinement and validation of the entire mouse collection was carried out by Spandidos and coworkers. Athanasia Spandidos, Xiaowei Wang, Huajun Wang, Stefan Dragnev, Tara Thurber and Brian Seed (2008) A comprehensive collection of experimentally validated primers for Polymerase Chain Reaction quantitation of murine transcript abundance. BMC Genomics 2008, 9:633


    Why should you use an annealing temperature about 5°C below the Tm of your primers? - مادة الاحياء

    The polymerase chain reaction (PCR) is a biomedical technology in molecular biology used to amplify a single copy or a few copies of a piece of DNA across several orders of magnitude, generating thousands to millions of copies of a particular DNA sequence. Developed in 1983 by Kary Mullis, PCR is now a common and often indispensable technique used in medical and biological research labs for a variety of applications. These include DNA cloning for sequencing, DNA-based phylogeny, or functional analysis of genes the diagnosis of hereditary diseases the identification of genetic fingerprints (used in forensic sciences and paternity testing) and the detection and diagnosis of infectious diseases.

    The method relies on thermal cycling, consisting of cycles of repeated heating and cooling of the reaction for DNA melting and enzymatic replication of the DNA. Primers (short DNA fragments) containing sequences complementary to the target region along with a DNA polymerase, after which the method is named, are key components to enable selective and repeated amplification.

    Almost all PCR applications employ a heat-stable DNA polymerase, such as Taq polymerase (an enzyme originally isolated from the bacterium Thermus aquaticus). This DNA polymerase enzymatically assembles a new DNA strand from DNA building-blocks, the nucleotides, by using single-stranded DNA as a template and DNA oligonucleotides (also called DNA primers), which are required for initiation of DNA synthesis.

    A basic PCR set up requires several components and reagents. These components include:

    • DNA template that contains the DNA region (target) to be amplified.
    • اثنين primers that are complementary to the 3′ (three prime) ends of each of the sense and anti-sense strand of the DNA target. or another DNA polymerase with a temperature optimum at around 70°C.
    • Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs, sometimes called “deoxynucleotide triphosphates” nucleotides containing triphosphate groups), the building-blocks from which the DNA polymerase synthesizes a new DNA strand. , providing a suitable chemical environment for optimum activity and stability of the DNA polymerase. cations, magnesium or manganese ions generally Mg2+is used, but Mn2+ can be utilized for PCR-mediated DNA mutagenesis, as higher Mn2+ concentration increases the error rate during DNA synthesis
    • Monovalent cationالبوتاسيوم

    إجراء

    Typically, PCR consists of a series of 20-40 repeated temperature changes, called cycles, with each cycle commonly consisting of 2-3 discrete temperature steps. The cycling is often preceded by a single temperature step at a high temperature (>90°C).

    Initialization step(Only required for DNA polymerases that require heat activation by hot-start PCR): This step consists of heating the reaction to a temperature of 94–96°C (or 98°C if extremely thermostable polymerases are used), which is held for 1–9 minutes.

    Denaturation step: This step is the first regular cycling event and consists of heating the reaction to 94–98°C for 20–30 seconds. It causes DNA melting of the DNA template by disrupting the hydrogen bonds between complementary bases, yielding single-stranded DNA molecules.

    Annealing step: The reaction temperature is lowered to 50–65°C for 20–40 seconds allowing annealing of the primers to the single-stranded DNA template. This temperature needs to be low enough to allow for hybridization of the primer to the strand, but high enough in order for the hybridization to be specific, i.e. the primer should only bind to a perfectly complementary part of the template. If the temperature is too low, the primer could bind imperfectly. If it is too high, the primer might not bind. Typically the annealing temperature is about 3–5°C below the Tm of the primers used. Stable DNA–DNA hydrogen bonds are only formed when the primer sequence very closely matches the template sequence. The polymerase binds to the primer-template hybrid and begins DNA formation.

    Extension/elongation step: The temperature at this step depends on the DNA polymerase used. Taq polymerase has its optimum activity temperature at 75–80°C, and commonly a temperature of 72°C is used with this enzyme. At this step the DNA polymerase synthesizes a new DNA strand complementary to the DNA template strand by adding dNTPs that are complementary to the template in 5′ to 3′ direction, condensing the 5′-phosphate group of the dNTPs with the 3′-hydroxyl group at the end of the nascent (extending) DNA strand. The extension time depends both on the DNA polymerase used and on the length of the DNA fragment to be amplified.

    Final elongation: This single step is occasionally performed at a temperature of 70–74°C (this is the temperature needed for optimal activity for most polymerases used in PCR) for 5–15 minutes after the last PCR cycle to ensure that any remaining single-stranded DNA is fully extended.

    Final hold: This step at 4–15°C for an indefinite time may be employed for short-term storage of the reaction.


    2.1: Amplify aptamer-encoding DNA

    Back when he was a postdoctoral fellow, Professor Niles screened a random library of RNA aptamers to find one that binds to heme &ndash the iron-containing site in hemoglobin. It is known that heme can bind to certain transcription factors and modulate gene expression (see references Zhang and Hach, 1999 و Ogawa, et al., 2001), and RNA aptamers are one potential tool for learning more about signaling networks involving heme. To select heme-binding aptamers, Professor Niles ran a pool of RNAs with 50 randomized base pairs through a heme affinity column. He then amplified the column-selected pool of aptamers and repeated the process several times. An aptamer called "6-5" survived through the 6th round of screening, but ultimately was found not to bind to heme. An aptamer called "8-12" survived through all 8 rounds of screening, and has a heme binding affinity of 220 nM. Both were described in the Niles, et al., 2006 paper referenced below.

    Today you will be given two archival plasmids containing the 6-5 and 8-12 sequences, respectively. RNA is not very stable compared to DNA thus, RNA aptamers are copied into their associated DNA sequences for long-term storage. Ligating the DNA fragment into a plasmid that can be carried in bacteria provides further amplification and storage capabilities. We will make use of these capabilities more extensively in Module 2.

    الشكل ( PageIndex <1> ): PCR schematic. Depicted are two complementary strands of DNA, with a desired target fragment shown in green. Primers that can select the target sequence are shown as short arrows, with the dotted lines indicating the extension step of PCR. Note that in the first couple rounds of PCR, products longer than the desired target will be made (dotted lines keep extending). However, these early products themselves become templates that produce the correct product in abundance.

    In order to select and amplify just the short DNA fragment that encodes for the aptamer, you will use the polymerase chain reaction, PCR. PCR comprises three main steps: 1) template DNA containing a desired sequence is melted, 2) primers anneal to specific locations on the now melted (i.e., single-stranded) DNA, and 3) the primers are extended by a polymerase to select and create the desired product. Extension occurs at

    95°C, and annealing at a temperature

    5 °C below the primer melting temperature thus, the repetition of these steps is called thermal cycling. After each cycle, the newly formed products themselves become templates, causing exponential amplification of the selected sequence. (Note that the early rounds of PCR will not produce the desired product - we will see why in today's pre-lab lecture.)

    Once the PCR is running, you will begin to explore some computational tools for RNA analysis. During this module, you will ultimately use three different programs to explore both sequence similarities among RNA candidate aptamers and higher-order structures that arise from the primary sequences. For today, you will look at degrees of sequence similarity among a list of aptamers, some of which bind to heme and some that don't.

    Figure (PageIndex<2>): (Photo by Mark Robert Halper. Courtesy of Kary Mullis. Used with permission.)

    Based on the numerous applications of PCR, it may seem that the technique has been around forever. In fact it is only 25 years old. In 1984, Kary Mullis described this technique for amplifying DNA of known or unknown sequence, realizing immediately the significance of his insight.

    "Dear Thor!," I exclaimed. I had solved the most annoying problems in DNA chemistry in a single lightening bolt. Abundance and distinction. With two oligonucleotides, DNA polymerase, and the four nucleosidetriphosphates I could make as much of a DNA sequence as I wanted and I could make it on a fragment of a specific size that I could distinguish easily. Somehow, I thought, it had to be an illusion. Otherwise it would change DNA chemistry forever. Otherwise it would make me famous. It was too easy. Someone else would have done it and I would surely have heard of it. We would be doing it all the time. What was I failing to see? "Jennifer, wake up. I've thought of something incredible." --Kary Mullis from his Nobel Lecture, December 8, 1983.


    الاستنتاجات

    Because the design of perfectly matching universal primers remains an unsolved problem ( Forney وآخرون., 2004), the investigation of PCR parameters that could attenuate the quantitative bias associated with preferential amplification caused by primer mismatch is very important. Newly designed domain-specific primers are usually tested with genomic DNA of strains and environmental samples for PCR amplification efficiency ( Marchesi وآخرون., 1998 Baker وآخرون., 2003), but preferential amplification should also be considered and tests carried out to determine the importance of this phenomenon. PCR optimization strategies for the assessment of environmental communities by ‘universal’ primer sets are directed to increasing the specificity of amplification using relatively high annealing temperature ( Hansen وآخرون., 1998) or ‘touch-down’ PCR protocol ( Simpson وآخرون., 2000). The results presented here suggest the opposite strategy for reducing preferential amplification using specific but low-stringency amplification. (1) PCR amplification should be optimized to reach the lowest annealing temperature, where the reaction is still specific and unspecific products (mispriming) are not observed. The cycle number can be high at this step. (2) PCR amplification should be repeated at the optimal temperature using parallel samples at low cycle numbers (around 25). In the case of low yield, parallel runs can be combined to obtain sufficient quantities for subsequent analyses.


    شاهد الفيديو: تصنيف المناطق الخطرة 04 التصنيف الحراري الخاص بالغازات والابخرة Temperature Classes (كانون الثاني 2022).