معلومة

هل يحدد معدل الأيض مدى سرعة تقصير التيلوميرات؟


في العديد من الأوراق يمكن للمرء أن يقرأ أن التيلوميرات قد تلعب دورًا مهمًا في طول العمر. وفقًا لـ Calado et al.1 تيلوميرات الفئران أطول بكثير من تيلوميرات البشر. ومع ذلك ، يبلغ متوسط ​​العمر المتوقع للفئران حوالي عامين والبشر حوالي 80 عامًا.

هل يحدد معدل الأيض إذن مدى سرعة تقصير التيلوميرات؟ هل يمكن للمرء أن يقول أنه كلما ارتفع معدل الأيض ، كلما كان التيلومير يقصر بشكل أسرع؟

  1. ديناميات التيلومير في الفئران والبشر

تقصير التيلومير والبقاء في الحياة الحرة

تتراكم الأدلة على أن تقصير التيلومير يعكس نمط الحياة ويتنبأ بالعمر المتبقي ، ولكن لا يُعرف سوى القليل عن ديناميكيات التيلومير وعلاقتها بالبقاء في ظل الظروف الطبيعية. نقدم بيانات طولية عن التيلومير في الغربان التي تعيش بحرية (كورفوس مونيدولا) واختبار الفرضيات حول تقصير التيلومير والبقاء على قيد الحياة. تم قياس التيلوميرات في كريات الدم الحمراء باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام النبضي. كانت معدلات تقصير التيلومير داخل الأفراد أعلى بمرتين من منحدر مستوى السكان ، مما يدل على أن الأفراد الذين لديهم تيلوميرات قصيرة هم أقل عرضة للبقاء على قيد الحياة. أظهر المزيد من التحليل أن معدل التقصير على وجه الخصوص توقع البقاء على قيد الحياة ، لأن تقصير التيلومير قد تسارع كثيرًا خلال العام الأخير للطيور في المستعمرة. كان تقصير التيلومير أسرع أيضًا في وقت مبكر من الحياة ، حتى بعد اكتمال النمو. لقد تم إثبات سابقًا أن أطوال أقصر التيلوميرات تتنبأ بشكل أفضل بالشيخوخة الخلوية ، مما يشير إلى أنه يجب حماية التيلوميرات الأقصر بشكل أفضل. نختبر الفرضية الأخيرة ونوضح أن التيلوميرات الطويلة داخل الأفراد تقصر أسرع من التيلوميرات القصيرة في البالغين والأفراخ ، وهي نتيجة لم تظهر من قبل في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، كان اختيار البقاء عند البالغين أكثر وضوحًا في التيلوميرات الطويلة نسبيًا. في الختام ، تشير بياناتنا الطولية إلى أن معدل تقصير التيلوميرات الطويلة قد يكون مقياسًا لضغط الحياة & # x02018 وبالتالي يحمل وعدًا كمؤشر حيوي للعمر المتبقي.


الملخص

العديد من الكائنات الحية قادرة على النمو بشكل أسرع مما تفعله. تم تفسير معدل النمو المقيد وظيفيًا من خلال التأثيرات السلبية على عمر النمو المتسارع. ومع ذلك ، لا تزال الآليات الأساسية بعيدة المنال. تم اقتراح استنزاف التيلومير كعامل مسبب وقد تمت دراسته في الغالب في الفقاريات الماصة للحرارة. لقد أثبتنا أن التيلوميرات موجودة كنهايات كروموسومية في حشرة نموذجية ، الكريكيت الميداني كامبستريس جريلوس، وذلك باستخدام جزء التقييد الطرفي و بال 31 أساليب. تتألف التيلوميرات من تكرارات TTAGGn بمعدل 38 كيلو بايت ، أي أطول بأربع مرات من التيلوميرات عند الرضع. بال 31 أكدت الاختبارات أن التكرارات التيلوميرية كانت موجودة في نهايات الكروموسوم. اختبرنا ما إذا كان النمو السريع بين اليوم الأول واليوم 65 واليوم 85 واليوم 125 يتحقق على حساب طول التيلومير من خلال مقارنة الحوريات التي تمت تربيتها عند 23 درجة مئوية مع إخوتها الذين تمت تربيتهم عند 28 درجة مئوية ، والتي نمت أسرع بثلاث مرات في أول 65 يومًا. والمثير للدهشة أن لا المعالجة بالحرارة ولا العمر يؤثران على متوسط ​​طول التيلومير. بالتزامن مع ذلك ، كان التوريث بالمعنى الواسع لطول التيلومير مرتفعًا بشكل ملحوظ

100٪. على الرغم من التوريث العالي ، كانت القابلية للتطور (مقياس متوسط ​​معياري للتباين الجيني) منخفضة بالنسبة إلى كتلة الجسم. نناقش النتائج التي توصلنا إليها في سياق تطور التيلومير. تتضح بعض السمات المهمة لبيولوجيا التيلومير لدى الفقاريات في أنواع الحشرات التي يعود تاريخها إلى العصر الترياسي. إن النقص الواضح في تأثير معدل النمو على طول التيلومير أمر محير ، مما يشير إلى الحفاظ على طول التيلومير القوي أثناء مرحلة النمو. ما إذا كانت هذه المحافظة على طول التيلومير تكيفية تظل بعيدة المنال وتتطلب مزيدًا من الدراسة للتحقق من الروابط مع اللياقة في البرية.


1 المقدمة

يُعتقد أن التباين في تاريخ الحياة ناتج عن التخصيص التفاضلي للموارد المحدودة لسمات تاريخ الحياة المتنافسة. قد تختلف مثل هذه المقايضات والتخصيص الأمثل للموارد الناتج مع الظروف البيئية (Stearns ، 1992). على سبيل المثال ، فضلت البيئات الاستوائية إيقاعًا بطيئًا للحياة ، أي تقليل الخصوبة ولكن زيادة العمر الافتراضي ، في العديد من الفقاريات (Ricklefs & Wikelski ، 2002). تمت دراسة هذا جيدًا بشكل خاص في الطيور حيث تنتج الأنواع الاستوائية ذرية أقل ولكن ذات جودة أعلى (Jetz ، Sekercioglu ، & Böhning-Gaese ، 2008 Martin ، 2015) ، لديها معدلات التمثيل الغذائي القاعدية المنخفضة (Tieleman et al. ، 2009 Wiersma ، Muñoz-Garcia ، Walker، & Williams، 2007) وتعيش أطول (Møller، 2007 Peach، Hanmer، & Oatley، 2001) من الأنواع المعتدلة. لذلك ، فإن المقارنة بين الأنواع الاستوائية والمعتدلة قد تكشف عن قيود فسيولوجية قد تحد من تطور التوليفات البديلة لسمات تاريخ الحياة (Ricklefs & Wikelski ، 2002).

تعتبر التيلوميرات إحدى الآليات المرشحة المهمة فيما يتعلق بالقيود الفسيولوجية للنمو والتكاثر والبقاء (Haussmann & Marchetto ، 2010). التيلوميرات عبارة عن أغطية بروتينية غير مشفرة في نهاية الكروموسومات حقيقية النواة تحمي سلامة الجينوم ، ولكنها تقصر أثناء انقسام الخلية ويحتمل أن تتعرض للإجهاد التأكسدي (Boonekamp، Bauch، Mulder، & Verhulst، 2017 Reichert & Stier، 2017 Zglinicki، 2002) . بشكل حاسم ، تؤدي التيلوميرات القصيرة في النهاية إلى شيخوخة الخلية أو موتها (بلاكبيرن ، 2000 ، 2005) ، وقد يكون تراكم الخلايا ذات التيلوميرات القصيرة أحد العوامل التي تسبب الشيخوخة والشيخوخة في الفقاريات (لوبيز أوتين ، بلاسكو ، بارتريدج ، سيرانو) ، & Kroemer، 2013).

تُظهر كل من الدراسات الطولية والمقطعية في الطيور أنه ، بشكل عام ، الأفراد الأكبر سنًا لديهم تيلوميرات أقصر من الأصغر سنا مع أكبر خسارة في التيلوميرات التي تحدث في وقت مبكر من الحياة (Heidinger et al. ، 2012 Pauliny ، Larsson ، & Blomqvist ، 2012 Salomons et al.، 2009 Spurgin et al.، 2018 Tricola et al.، 2018). علاوة على ذلك ، يُظهر عدد متزايد من الدراسات التي أجريت على الطيور أن الأفراد الذين لديهم تيلوميرات أطول أو القليل من استنزاف التيلومير لديهم فرص أفضل للبقاء على قيد الحياة من الأفراد الذين لديهم تيلوميرات قصيرة أو مستويات عالية من استنزاف التيلومير (تمت المراجعة في Wilbourn et al. ، 2018). تمت دراسة هذا جيدًا بشكل خاص في عصافير الحمار الوحشي (Taeniopygia guttata) ، الذي ثبت أن التيلوميرات الطويلة في الحياة المبكرة مرتبطة بزيادة البقاء وطول العمر (Heidinger et al. ، 2012). بالإضافة إلى ذلك ، تُظهر الدراسات في مجموعة متنوعة من الأنواع أن ديناميكيات التيلومير حساسة للتأثيرات البيئية مثل الاختلافات في توافر الغذاء (Spurgin et al. ، 2018) ، والأمراض الطفيلية (Asghar et al. ، 2015) ، والتعرض للإجهاد (Hau). وآخرون ، 2015). على وجه الخصوص ، يمكن أن تؤثر الظروف التي تمت مواجهتها أثناء التطور على ديناميكيات التيلومير. على سبيل المثال ، يمكن أن يؤدي التعرض للبيئات الفقيرة أو المجهدة إلى فقدان التيلومير المتسارع في الطيور الصغيرة (كوستانزو وآخرون ، 2017 Haussmann ، Longenecker ، Marchetto ، Juliano ، & Bowden ، 2012 Herborn et al. ، 2014 Nettle et al. ، 2017 Salmon ، Nilsson، Nord، Bensch، & Isaksson، 2016 Soler et al.، 2017 Young et al.، 2017) ، والتي يمكن أن تنبئ بانخفاض معدل البقاء على قيد الحياة كأفراخ أو فراخ (Boonekamp، Mulder، Salomons، Dijkstra، & Verhulst، 2014 Salmon ، Nilsson، Watson، Bensch، & Isaksson، 2017 Watson، Bolton، & Monaghan، 2015). وبالتالي ، يعتبر طول التيلومير ومعدل فقد التيلومير من المؤشرات الحيوية لصحة الفرد وجودته (Young ، 2018).

قارنت دراسات أقل بين طول التيلومير بين الأصناف التي تختلف في تاريخ حياتها ومدى حياتها. في الثدييات ، وجدت دراسة مقارنة أن الأنواع الصغيرة قصيرة العمر لها تيلوميرات أطول وتعبير تيلوميراز أعلى من الأنواع الكبيرة طويلة العمر (جوميز وآخرون ، 2011). في دراسة أجريت على القوارض ، لم يتم الكشف عن أي علاقة بين أقصى عمر وطول التيلومير (Seluanov et al. ، 2007). في الطيور ، لا يبدو أن طول التيلومير المطلق مرتبط بالاختلاف في العمر بين الأنواع ، ومع ذلك ، يبدو أن أنواع الطيور ذات العمر الأطول لديها معدلات أقل من تقصير التيلومير مقارنة بالأنواع قصيرة العمر (Dantzer & Fletcher، 2015 Haussmann et al.، 2003 Sudyka ، Arct، Drobniak، Gustafsson، & Cichoan، 2016 Tricola et al.، 2018). قد تكون هذه العلاقة بين معدل فقدان التيلومير والحد الأقصى لعمر الطيور ناتجًا عن الاختلاف بين الأنواع في كيفية الحفاظ على التيلوميرات طوال فترة حياتها. بالإضافة إلى ذلك ، قد يعكس الاختفاء الانتقائي للأفراد ذوي الجودة المنخفضة مع التيلوميرات القصيرة. في الأنواع ذات العمر الأطول ، التي تعاني من مستويات أقل من الوفيات الخارجية ، قد تلعب الحالة الفردية ، وبالتالي ديناميكيات التيلومير ، دورًا أكبر كمحددات للوفاة (كيركوود وأوستاد ، 2000). لذلك ، قد يكون الاختفاء الانتقائي للأفراد ذوي التيلوميرات القصيرة أكثر وضوحًا في الأنواع طويلة العمر (Tricola et al. ، 2018).

تعيش الأنواع الاستوائية في بيئات موسمية أقل مع مستويات أقل من الوفيات الخارجية للبالغين مقارنة بالبيئات المعتدلة (براون ، 2014). وبالتالي ، فإن احتمالات بقاء الطيور المغردة الاستوائية أعلى من احتمالات بقاء الطيور المعتدلة (Martin et al.، 2017 Muñoz، Kéry، Martins، & Ferraz، 2018). لذلك ، من المتوقع حدوث اختفاء انتقائي أقوى للأفراد ذوي التيلوميرات القصيرة في المناطق الاستوائية مقارنة بالطيور المعتدلة. ومع ذلك ، فإن معدلات الوفيات محددة حسب العمر ، وبالتالي ، فإن قوة الاختفاء الانتقائي قد تختلف مع تقدم العمر. في الطيور ، عادة ما يكون معدل النفوق أعلى خلال السنة الأولى من الحياة ، خاصة بعد النمو مباشرة (Cox، Thompson، Cox، & Faaborg، 2014 Naef-Daenzer & Grüebler، 2016). كما تنبأت نظرية تاريخ الحياة (McNamara، Barta، Wikelski، & Houston، 2008) ، فإن بقاء الأحداث أعلى بشكل عام في المناطق الاستوائية مقارنة بالطيور المعتدلة (Lloyd، Martin، & Roskaft، 2016 Remes & Matysiokova، 2016). يعتني الآباء المداريون بعدد أقل من طيورهم الصغيرة لفترة أطول بكثير من الطيور المعتدلة ، وبالتالي قد يكونون قادرين على خفض معدل النفوق الخارجي في الأحداث (Styrsky ، Brawn ، & Robinson ، 2005). لذلك ، نفترض أن البقاء التفاضلي للطيور عالية الجودة يجب أن يكون أكثر وضوحًا في المناطق الاستوائية مقارنة بالطيور المعتدلة. بافتراض أن التيلوميرات هي مؤشرات بيولوجية للحالة الجسدية والجودة الفردية ، فإننا نتوقع أنه في الطيور الاستوائية ، يختفي الأفراد ذوو التيلوميرات القصيرة بشكل أسرع من السكان مقارنة بالطيور المعتدلة خلال السنة الأولى الحرجة من الحياة وفيما بعد كبالغين.

بالإضافة إلى ذلك ، هناك أدلة جيدة على أن الأنواع الاستوائية تستثمر أكثر في الصيانة الذاتية ، ولكنها أقل خصوبة من الأنواع المعتدلة. على سبيل المثال ، تُظهر الأنواع الاستوائية سلوكًا مرضيًا أقوى بعد الإصابة خلال موسم التكاثر من الأنواع المعتدلة (Owen-Ashley، Hasselquist، Raberg، Wingfield، 2008). علاوة على ذلك ، في الأنواع الاستوائية ، يتم تقليل عبء العمل الإنجابي لأنها تضع قوابض أصغر ، وبالتالي فهي ترعى صغارًا أقل وتستهلك طاقة أقل من الطيور المعتدلة (Nilsson ، 2002 Tieleman et al. ، 2006). وبالتالي ، قد تقلل المستويات العالية من الإجهاد التأكسدي (Noguera ، 2017) وفقدان التيلومير المحتمل المرتبط بالتكاثر (Reichert et al. ، 2014). بالإضافة إلى ذلك ، يبدو أن الطيور المغردة الاستوائية لديها معدلات استقلاب منخفضة بعد الولادة ونمو أبطأ وأكثر استدامة على الرغم من أوقات التعشيش المماثلة للطيور المعتدلة (Martin ، 2015 Ton & Martin ، 2016). قد تؤدي مسارات النمو البطيئة هذه إلى جانب زيادة رعاية الوالدين لكل نسل إلى انخفاض مستويات استنزاف التيلومير أثناء الحياة المبكرة في الطيور الاستوائية ، والتي بدورها قد تكون محددات مهمة لفترات حياتها الأطول (Monaghan & Ozanne ، 2018). وبالتالي ، من المتوقع أن تُظهر الأنواع الاستوائية ذات العمر الأطول ، والتي تستثمر في النمو والحفاظ على الذات أكثر من الخصوبة ، تيلوميرات أطول كأفراخ أو معدل أبطأ لفقدان التيلومير من الأنواع المعتدلة قصيرة العمر. لتحديد كيف شكل تغير تاريخ الحياة التباين في التيلوميرات ، من الضروري إجراء مقارنات بين الأنواع نفسها أو الأنواع ذات الصلة الوثيقة في بيئات مختلفة.

قمنا بجمع عينات من الأفروتروبيكال (يشار إليها باسم الاستوائية) والأوروبية المعتدلة (يشار إليها باسم المعتدلة) من الذكور الحجرية من أفراد مختلفين في أربع فئات عمرية: كأفراخ ، كطيور السنة الأولى قبل التكاثر (خلال الأشهر الستة الأولى من حياتها) ، خلال موسم تكاثرهم الأول (

1 سنة) ، وأثناء حياتهم بعد البلوغ (2 سنة). بسبب بطء وتيرة الحياة ، من المتوقع أن تعطي الحجارة الاستوائية الأولوية للصيانة الجسدية على الخصوبة. وبالتالي ، توقعنا وجود تيلوميرات أطول في المناطق المدارية مقارنةً بالحجر الحجري المعتدل. علاوة على ذلك ، نظرًا لارتفاع معدل بقاء الأحداث على قيد الحياة والرعاية الأبوية الممتدة ، فقد توقعنا انخفاضًا طفيفًا في طول التيلومير خلال السنة الأولى من العمر في المناطق المدارية مقارنةً بالحجارة الحجرية المعتدلة.


2. المواد والأساليب

2.1 كائن الدراسة

9 أشهر) تنانين إناث (Ctenophorus pictus، دبليو بيترز ، 1866) بواسطة حبل المشنقة أو باليد في محمية ياثونغ الطبيعية ، نيو ساوث ويلز ، أستراليا (145 درجة 35 شرقا 32 درجة 35 درجة جنوبا) وتم نقلهم إلى مرافق احتجاز في جامعة سيدني في أكتوبر 2015 حيث تم إيواؤهم لمدة التجارب. تم جمع الحيوانات بموجب تصريح صادر عن NSW National Parks and Wildlife Service (SL100352) ، وأجريت التجارب وفقًا لموافقة أخلاقيات جامعة سيدني (AEC-2013/6050). تم إيواء الإناث في أزواج في أحواض بلاستيكية غير شفافة (330 × 520 × 360 مم) مع ركيزة رملية وتعرضت لضوء مدته 12 ساعة: دورة مظلمة مدتها 12 ساعة. تم إطعام السحالي ديدان الوجبة والصراصير ، وغبارها بالكالسيوم والفيتامينات المتعددة ، لإشباعها كل يوم ، وتم رش الأقفاص بالماء مرة واحدة في اليوم. تم توفير مصابيح الحرارة والجلود الخزفية للسماح للسحالي بالتنظيم الحراري لدرجة حرارة الجسم المفضلة (36 درجة مئوية MO ، بيانات غير منشورة تم الحصول عليها من قراءات درجة حرارة المذرق في البرية). كانت كومة من الرمل الرطب متوفرة في كل حوض للسماح للإناث بالحفر ووضع البيض. تم فحص الإناث كل يوم من أجل وضع البيض ، كما يتضح من اللوحات الجلدية حول البطن. بشكل عام ، أنتجت 18 أنثى 22 قابضًا و 89 بيضة في المجموع بين 4 نوفمبر 2015 و 6 يناير 2016. تمت إزالة البيض ووزنه إلى أقرب 0.1 جرام. كجزء من التحقيق في تأثيرات درجة الحرارة على TL ، تم بعد ذلك وضع البيض الفردي من كل مخلب بالتتابع في واحدة من أربع حاضنات (27 ، 30 ، 32 ، 36 درجة مئوية ، ± 0.5 درجة مئوية) لفصل تأثيرات القابض ودرجة الحرارة . تم دفن نصف البيض في مزيج 1: 7 من الماء إلى الفيرميكيولايت في حاويات محكمة الإغلاق وشفافة في كل حاضنة. تم إغلاق الحاويات لتقليل تبخر الماء ولكن تم تهويتها أسبوعياً. تم فحص البيض يوميًا بحثًا عن بيض غير قابل للحياة ، وتم إزالته. فقست ثلاثة وسبعون تنينًا وأزيلت 16 بيضة غير قابلة للحياة (معظمها من حاضنة 36 درجة مئوية ، وهي أكثر دفئًا من درجة حرارة الحضانة المقدرة في البرية: حوالي 30 درجة مئوية ، M.O. ، بيانات غير منشورة). تم تحديد جنس الفقس (تم تحديده من خلال وجود أو عدم وجود hemipenes) ، ووزنها لأقرب 0.1 جم ، وطول فتحة الأنف (SVL) وتم قياس الطول الإجمالي لأقرب مم. تم تمييز كل فرد بنمط مشبك فريد من نوعه لتحديد الهوية. ثم تم وضع الأفراد في مجموعات في أحواض بنفس الظروف مثل الإناث البالغات ، باستثناء الكومة الرملية. تم تغذية صراصير رأس الدبوس بالغبار بالكالسيوم والفيتامينات المتعددة حتى تشبع تنانين الفقس كل يوم. معدل الوفيات مرتفع في تنانين الأحداث المصبوغة ولكن تم فحص الأحواض عدة مرات في اليوم وتم إزالة أي أفراد ميتين على الفور.

2.2 جمع العينات

في مارس 2016 ، تم احتضان الأحداث الـ 24 المتبقية (14 أنثى ، 10 ذكور ، تتراوح أعمارهم من 97 إلى 140 يومًا ، حضانة أنثى واحدة و 3 ذكور عند درجة حرارة 27 درجة مئوية ، و 6 إناث و 5 ذكور عند درجة حرارة 30 درجة مئوية ، و 5 إناث و 2. تم تحضين الذكور عند 32 درجة مئوية ، تم قتل إناث محتضنة عند 36 درجة مئوية عن طريق قطع الرأس. قبل قطع الرأس تم تخدير الأفراد أولاً عن طريق التبريد في الثلاجة لمدة 10 دقائق وفي المجمد لمدة دقيقتين. تم اختبارهم جنسياً مرة أخرى لتأكيد التخصيصات السابقة ، ووزنهم إلى أقرب 0.1 جم ، و SVL والطول الإجمالي المقاس لأقرب مم. ثم تم جمع الدم الكامل والدماغ كله والقلب والكبد والطحال. تم وضع كل نوع من الأنسجة في 300 ميكرولتر من RNAlater (Sigma-Aldrich ، Castle Hill ، NSW ، أستراليا) وتم تخزينها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي.

2.3 تحديد طول التيلومير النسبي

لتحليل طول التيلومير النسبي (RTL بالنسبة لجين 18S) ، قمنا أولاً بتنقية الحمض النووي من الأنسجة التي تم جمعها. تم تقطيع الدماغ والقلب والكبد إلى قطع صغيرة ، واستخدم 50 ميكرولتر من الدم المخفف في الاستخراج. تم استخدام مجموعة DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen ، Chadstone ، VIC ، أستراليا) لعمليات الاستخراج ، وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تشغيل خطوة هضم بروتين كيناز لمدة 10 دقائق للدم ، لكن الدماغ والقلب والكبد والطحال يتطلب حضانة طوال الليل من أجل الهضم الكامل. تمت إضافة RNase A (Qiagen ، Chadstone ، VIC ، أستراليا) بالتركيز الموصى به. تم قياس تركيز الحمض النووي (نانوغرام / ميكرولتر) ونسبة A260: A280 لكل عينة في نسختين باستخدام Nanodrop (Thermo Fisher Scientific) وقسامات مخففة إلى 10 نانوغرام / ميكرولتر باستخدام عازلة AE المتوفرة في مجموعة استخراج الحمض النووي. فقط العينات ذات نسبة A260: A280 بين 1.7 و 1.9 وتركيز أعلى من 10 نانوغرام / ميكرولتر اعتبرت عالية الجودة بما يكفي لاستخدامها في التحليلات. أخيرًا ، 22 دمًا (12 أنثى ، 10 ذكور) ، 18 كبدًا (9 إناث ، 9 ذكور) ، 17 قلبًا (8 إناث ، 9 ذكور) ، دماغ 16 (11 أنثى ، 5 ذكور) ، 10 طحال (6 إناث ، 4 ذكور) الذكور) كانت ذات جودة كافية لاستخدامها في الدراسة. تم تخزين الحمض النووي عند -30 درجة مئوية.

تم قياس طول التيلومير باستخدام PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR) باستخدام SensiMix SYBR No-ROX Kit (Bioline ، سيدني ، نيو ساوث ويلز ، أستراليا) وجين Rotor-gene 6000 (Qiagen ، Chadstone ، VIC ، أستراليا) وفقًا للبروتوكولات المنشورة ( Rollings ، Friesen ، وآخرون ، 2017 Rollings ، Uhrig ، وآخرون ، 2017) باستخدام التقنيات التي طورها Criscuolo et al. (2009) و Plot و Criscuolo و Zahn و Georges (2012) مع جين 18S ribosomal RNA (18S) باعتباره الجين المرجعي لرقم النسخ غير المتغير. كانت بادئات التيلومير المستخدمة هي Telb1 (5′-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-3 ′) و Telb2 (5′-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT).

جين 18S (92 bp amplicon in أنوليس) باعتباره الجين المرجعي كما تم التحقق من صحته مسبقًا في الزواحف (Plot et al. ، 2012 Rollings ، Uhrig ، et al. ، 2017). تسلسل التمهيدي المستخدم كان 18S-F (5′-GAGGTGAAATTCTTGGACCGG-3 ′) و 18 S-R (5′-CGAACCTCCGACTTTCGTTCT-3). تم تشغيل التفاعلات في ثلاث نسخ لكل عينة ، مع كل تشغيل يحتوي على بادئات Telb أو 18S.تم إجراء عمليات التضخيم في جهاز تدوير حراري Rotor-Gene 6000 (Qiagen ، أستراليا) باستخدام خطوة تنشيط أولية Taq عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ومجموع 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 60 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 15 ثانية. كان لكل تفاعل حجم نهائي قدره 20 ميكرولتر مع 10 نانوغرام من الحمض النووي ، والبادئات الأمامية والعكسية المستخدمة بتركيز 250 نانومتر ، و MgCl2 يضاف لتركيز 1.7 ملم. تمت إضافة 11.25 ميكرولتر من SensiMix SYBR No-ROX Master Mix لكل تفاعل. تم إنشاء منحنى الذوبان بعد كل جولة على مدى درجة الحرارة من 60 إلى 95 درجة مئوية لضمان عدم وجود تضخيم غير محدد للمنتج (انظر الملحق S1 والشكل S2 للحصول على أمثلة). تم تضمين جميع عينات الحمض النووي لفرد معين في نفس الجولة. تم تشغيل تفاعلات التحكم بدون قالب في ثلاث نسخ لكل مجموعة تمهيدي خلال كل تشغيل qPCR لضمان عدم وجود تلوث. تم إنتاج منحنيات قياسية ، باستخدام الحمض النووي المجمع من ثلاثة سحالي تم اختيارها عشوائيًا ، لكل من التيلوميرات و 18 S باستخدام التخفيفات التسلسلية بأربعة أضعاف لضمان معدلات تضخيم متسقة على نطاق واسع من التركيزات (60 نانوغرام / ميكرولتر وصولاً إلى 0.05859 نانوغرام / ميكرولتر مع 6 مختلفة. التركيزات في المجموع: الشكل التذييل S3 والشكل S4) يعطي مدى ديناميكي خطي من 0.05859 إلى 60 نانوغرام / ميكرولتر. تم اعتبار التفاعل متسقًا عندما تجاوز معامل الارتباط الخطي 0.985. كانت كفاءة تضخيم التيلومير 1.17 وكانت كفاءة تضخيم 18S 0.97 ، ووقعت العينات جميعها في نفس نطاق التركيز مثل معاييرنا. تضمنت جميع عمليات التشغيل نفس "المعيار الذهبي" وأيضًا عنصر تحكم بدون قالب لاكتشاف التلوث. تم استخدام LinRegPCR 2016.0 (مركز أبحاث فشل القلب ، Ruijter et al. ، 2009 ، Tuomi ، Voorbraak ، Jones ، & Ruijter ، 2010) لتحليل بيانات qPCR. تم استخدام تركيزات البداية من التيلومير (T) وجين التحكم (S 18S) كما هو محدد باستخدام LinRegPCR لتحديد طول التيلومير النسبي باستخدام حساب T / S. تم تقييم التيلوميرات وجين التحكم في عمليات منفصلة. متوسط ​​معامل التباين للتشغيل qPCR للتيلومير (ن = 4) و 18 ثانية (ن = 4) كان التضخيم 2.98٪ و 0.59٪ على التوالي محسوبًا باستخدام المعيار الذهبي. كان معامل الاختلاف داخل الاختبار لتشغيل التيلومير و 18 S 1.09٪ و 0.90٪ على التوالي. لم يجد النموذج الخطي العام فرقًا معنويًا في توزيع الجنسين بين الصفائح (F1,23 = 1.211, ص = 0.283). للتحقيق في تأثيرات التشغيل المحتملة ، أخذنا القيمة المتوسطة لكل ثلاث نسخ كما أنتجها LinRegPCR لبيانات الدم لتبسيط التحليل. لم تظهر ANOVA من بيانات 18S المحولة (للحالة الطبيعية) أي فرق كبير بين الأشواط (F3,18 = 0.795, ص = 0.513) وكذلك لم يتم التشغيل الذي يحتوي على telb (F3,18 = 0.888, ص & LT 0.466).

2.4 التحليلات الإحصائية

أجريت التحليلات باستخدام SAS 9.4 (SAS Institute ، Cary) و SPSS 25.0 (IBM ، Armonk). تم تحويل RTL من أجل التوافق مع الوضع الطبيعي ، كما تم التحقق من ذلك باختبار Shapiro-Wilk. تم تقييم الآثار المحتملة لحالة الجسم (BCI) من خلال إنشاء بقايا تحليل الانحدار للكتلة مقابل SVL عند الوفاة. أولاً ، لاختبار ما إذا كانت الحضانة عند درجات حرارة مختلفة قد أثرت على النتائج ، تم إجراء تحليل نموذج مختلط للعلاقة بين RTL ودرجة حرارة الحضانة ، مع معرف الفرد ومعرف الأم كعوامل عشوائية ، ووجد أنه غير مهم (F1,15.1 = 0.17, ص = 0.6818, ن = 78). لمزيد من التحقيق في الآثار المحتملة لدرجة حرارة الحضانة ، تم حساب معاملات ارتباط بيرسون لدرجة الحرارة ووقت الحضانة وكتلة الفقس. تم إجراء ارتباطات بيرسون بين RTL و SVL عند الفقس والموت ، والكتلة عند الفقس والموت ، و BCI المتبقية عند الوفاة ، والعمر عند الوفاة ، ومعدل النمو (محسوبة بالفرق بين الفقس والوفاة SVL مقسومًا على العمر). تم أيضًا حساب معاملات ارتباط بيرسون للتيلوميرات لجميع مجموعات أنواع الأنسجة لاختبار التشابه في ديناميات التيلومير عبر الأنسجة. لقد اخترنا عدم تطبيق تصحيح (على سبيل المثال ، Bonferroni) على هذا التحليل على الرغم من عدد الارتباطات التي تم اختبارها نظرًا لأن أحجام العينات المنخفضة المتاحة تحد من قوتنا الإحصائية وتزيد من احتمال حدوث أخطاء من النوع الثاني. سيؤدي تطبيق التصحيح إلى زيادة فرصة حدوث أخطاء من النوع الثاني وتقليل احتمالية اكتشاف التأثيرات الحقيقية (ناكاجاوا ، 2004). لاختبار تأثيرات التيلومير الخاصة بالجنس والعضو ، تم اختبار تحليل نموذج مختلط للعلاقة بين RTL والجنس ، تم اختبار نوع العضو والتفاعل بين الجنس والعضو مع معرف متضمن للتحكم في مقاييس متعددة من نفس الفرد. لم يكن تفاعل الجنس × نوع الجهاز معنويًا (F4,73 = 1.206, ص = 0.316) ولكن تم الإبقاء عليه في النموذج النهائي لأنه أدى إلى انخفاض احتمال تسجيل الدقة بمقدار 2 Res. عندما تم الكشف عن تأثيرات نوع العضو ، تم إجراء تباينات زوجية بين كل نوع من الأعضاء. تم إجراء تعديلات Bonferroni المتسلسلة لجميع التباينات الزوجية. نظرًا لوجود اختلافات قائمة على الجنس في RTL ، تم اختبار GLMs الاختلافات القائمة على الجنس في SVL عند الفقس والموت ، والكتلة عند الفقس والموت ، وتم إجراء BCI المتبقية عند الوفاة ، والعمر ، ومعدل النمو لتحديد ما إذا كانت الاختلافات في الحجم قد تكون مسؤولة عن الاختلاف في RTL.


معدل فقدان التيلومير مرتبط بالعمر الأقصى للطيور

التيلوميرات هي مناطق محمية للغاية من الحمض النووي تحمي نهايات الكروموسومات الخطية. يمكن أن يشير فقدان التيلوميرات إلى تغيير لا رجعة فيه في حالة الخلية ، بما في ذلك الشيخوخة الخلوية. لم تعد الخلايا الشائخة تنقسم ويمكن أن تلحق الضرر بالخلايا السليمة القريبة ، وبالتالي من المحتمل أن تضعها في مفترق طرق السرطان والشيخوخة. في حين أن علم الأوبئة والبيولوجيا الخلوية والجزيئية للتيلوميرات مدروسة جيدًا ، فإن مجالًا جديدًا يستكشف بيولوجيا التيلومير في سياق البيئة والتطور آخذ في الظهور للتو. مع العمل حتى الآن الذي يركز على كيفية ارتباط تقصير التيلومير بالوفيات الفردية ، لا يُعرف الكثير عن كيفية ارتباط التيلوميرات بمعدلات الشيخوخة عبر الأنواع. هنا ، قمنا بالتحقيق في طول التيلومير في عينات مقطعية من 19 نوعًا من الطيور لتحديد كيفية ارتباط معدلات فقدان التيلومير بالتباين بين الأنواع في الحد الأقصى للعمر. وجدنا أن أنواع الطيور ذات الأعمار الأطول تفقد عددًا أقل من تكرار التيلوميرات كل عام مقارنةً بالأنواع ذات الأعمار الأقصر. بالإضافة إلى ذلك ، كشف تحليل علم الوراثة أن معدل فقدان التيلومير محفوظ تطوريًا داخل عائلات الطيور. يشير هذا إلى أن الأسباب الفسيولوجية لتقصير التيلومير ، أو القدرة على الحفاظ على التيلوميرات ، هي سمات قد تكون مسؤولة عن ، أو تتطور بشكل مشترك ، مع مختلف الأعمار التي لوحظت عبر الأنواع.

هذه المقالة جزء من موضوع موضوع "فهم التنوع في ديناميكيات التيلومير".

1 المقدمة

مع تقدم العمر ، تعاني الكائنات الحية من تدهور وظيفي تدريجي يؤدي إلى تضاؤل ​​الأداء وزيادة خطر الوفاة. في حين أن الشيخوخة ، أو الشيخوخة ، أمر شائع بين المجموعات التصنيفية ، فإن نمط ووتيرة عملية الشيخوخة متغيرين داخل الأنواع وفيما بينها [1]. يظل فهم العمليات التي تكمن وراء هذا الاختلاف سؤالًا مركزيًا عبر مختلف مجالات علم الأحياء. ضمن علم الأحياء التطوري ، يمكن للفهم الأفضل لأسس عملية الشيخوخة أن يعطي في النهاية نظرة ثاقبة لمقايضات تاريخ الحياة وتطور الأعمار [2].

أحد العوامل التي تسهم في شيخوخة النمط الظاهري هو الشيخوخة الخلوية [3،4]. تؤدي هذه العملية إلى تغيير لا رجعة فيه في حالة الخلية ، حيث تتوقف الخلية عن الانقسام وتخضع لتغييرات نمطية مميزة ، بما في ذلك المظهر الإفرازي المتغير الذي يمكن أن يتلف الخلايا السليمة القريبة [3،5]. نظرًا لارتفاع عدد الخلايا الشائخة أثناء عملية الشيخوخة ، هناك فقدان متزايد للقدرة التجديدية للخلايا مع تقدم العمر [6]. يحدث الشيخوخة الخلوية كاستجابة معقدة للضغوط المفرطة خارج الخلية أو داخل الخلايا ، بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، تلف الحمض النووي الشديد ، وتدهور الميتوكوندريا ، والإجهاد التأكسدي ، وخلل التيلومير [5]. يؤدي التآكل التدريجي للتيلوميرات ، تسلسل الحمض النووي غير المشفر في نهاية الكروموسومات حقيقية النواة الخطية ، في النهاية إلى استجابة تلف دائم للحمض النووي تؤدي إلى دخول الخلايا في مرحلة الشيخوخة [7]. في حين أن تقصير التيلومير هو عامل واحد فقط يساهم في الشيخوخة الخلوية ، فقد أصبح مؤشرًا حيويًا للخلايا الشائخة [8] والحالة الفسيولوجية للكائن الحي [9،10].

تتوافق بنية التيلوميرات بشكل عام عبر حقيقيات النوى ، مما يشير إلى أن التيلوميرات هي حارس قديم وفعال للجينوم [11]. تمشيا مع هذا ، تلعب التيلوميرات دورًا واسعًا في الحفاظ على الاستقرار الجيني للكروموسومات. عادةً ما تنثني نهاية التيلومير مرة أخرى على نفسها لتشكيل بنية يُشار إليها باسم "حلقة T" ، جنبًا إلى جنب مع البروتينات المرتبطة بها ، تعمل بشكل فعال على تغطية نهايات الكروموسومات. ومع ذلك ، مع تكاثر الخلايا ، تقصر التيلوميرات الخاصة بها بسبب قيود النسخ المتماثل لبوليميراز الحمض النووي في نهايات الكروموسومات [12]. يمكن أيضًا نشر تقصير التيلومير أثناء تكرار الحمض النووي عن طريق فواصل أحادية السلسلة في مناطق التيلومير بسبب الإجهاد التأكسدي [13]. سيؤدي هذا التقصير التدريجي للتيلومير في النهاية إلى كشف نهاية كروموسوم حر غير مغطى يؤدي إلى توقف دائم لدورة الخلية [14]. إذًا ، فإن خلل التيلومير يزيد من مجموعة الخلايا المتشيخة المتزايدة باستمرار ويمكن أن يساهم بالتالي في تدهور وظيفة الأنسجة وسلامتها ، وهو ما يعد سمة مميزة للشيخوخة [15].

تشير الروابط بين فقدان التيلومير والشيخوخة الخلوية إلى دور مهم لتقصير التيلومير في التدهور المرتبط بالعمر في الوظيفة الفسيولوجية. لدعم ذلك ، وجد عدد من الدراسات البشرية أن الأفراد ذوي التيلوميرات الأقصر لديهم أيضًا انخفاض في متوسط ​​العمر المتوقع [16-19] ، على الرغم من أن الدراسات الأخرى لا تبلغ عن هذه العلاقة [18 ، 20 ، 21] ، وانظر [22] للاطلاع على مناقشة الدور السببي لتقصير التيلومير في الشيخوخة. أفاد أحد التحليلات المثيرة للاهتمام بشكل خاص داخل الزوجين للتوائم السويدية أن التوأم الذي له طول تيلومير أقصر كان لديه أيضًا معدل وفيات أعلى بثلاث مرات من توأمهما [19]. بشكل متناسق ، يظهر عدد متزايد من الدراسات غير البشرية في التجمعات الطبيعية ، خاصة في الطيور البرية ، أيضًا أن احتمالات البقاء على قيد الحياة مرتبطة بطول التيلومير [23-30]. ويشير تقرير بارز عن عصافير الزيبرا إلى أن طول التيلومير المبكر (عند عمر 25 يومًا) هو مؤشر قوي جدًا على طول العمر [30].

في حين أن عدد الدراسات التي تستكشف الروابط بين طول التيلومير والبقاء داخل الأنواع يستمر في النمو ، كان هناك عدد قليل نسبيًا من الدراسات المقارنة التي تستكشف كيفية ارتباط بيولوجيا التيلومير بمعدلات الشيخوخة أو العمر الافتراضي بين الأنواع. توفر الدراسات المقارنة أداة قوية لاستكشاف تطور الفقاريات للشيخوخة في البرية حيث تستفيد هذه الدراسات من ثروة التباين في الأعمار بين الأنواع الناتجة عن الانتقاء طويل الأجل عبر بيئات مختلفة. على وجه الخصوص ، تعد الطيور نموذجًا جذابًا بشكل خاص للدراسات المقارنة للشيخوخة حيث يتم مراقبتها بشكل ملائم باستخدام الرنين وتظهر تنوعًا كبيرًا في سمات تاريخ الحياة [31].

أظهر العمل المقارن أنه بينما لا يبدو أن طول التيلومير المطلق يتعلق بطول العمر بين الأنواع ([32-35] ، لكن انظر [11]) ، فإن المعدل الذي تقصر به التيلوميرات قد يوفر رؤية أفضل لتطور عمر الأنواع [35]. الدراسة الأولى ، التي أجريت منذ ما يقرب من 15 عامًا ، وجدت أن معدلات تدهور التيلومير الخاصة بالأنواع تنبئ بأقصى عمر بين خمسة أنواع من الطيور وثمانية أنواع من الثدييات [35]. على حد علمنا ، منذ ذلك الوقت ، قامت دراستان إضافيتان فقط باستكشاف هذا السؤال ، وكلاهما يدعم النتيجة الأصلية ، مما يشير إلى أن التباين في معدلات تحلل التيلومير بين الأنواع يدل على مستويات متميزة من صيانة التيلومير [36 ، 37]. حققت هذه الدراسات بعض التقدم في التصميم والتحليل التجريبيين حيث أدى Dantzer و Fletcher [36] إلى زيادة عدد الأنواع التي تمت دراستها أثناء التحكم في علم التطور ، و Sudyka وآخرون. [37] ركز على مجموعات البيانات الطولية. ومع ذلك ، اعتمدت كلتا الدراستين أيضًا على البيانات الموجودة مسبقًا والتي تم إنشاؤها بواسطة مجموعة متنوعة من التقنيات لقياس طول التيلومير وحتى داخل طريقة ما ، يمكن للمختبرات المختلفة أن تنتج نتائج مختلفة على نطاق واسع [38 ، 39]. بالإضافة إلى ذلك ، تطبق العديد من هذه الدراسات طريقة qPCR النسبية لقياس التيلومير. في حين أن هذه التقنية تقدم قياسات سريعة وقابلة للمقارنة للتيلومير في إحدى الدراسات ، إلا أنها غير مناسبة لمقارنات طول التيلومير الكمية بين المختبرات أو الأنواع [39]. بدلاً من ذلك ، فإن مقايسة جزء تقييد التيلومير (TRF) تستغرق وقتًا أطول ولكنها توفر طولًا مطلقًا للتيلومير بناءً على علامة جزيئية فيزيائية تنتج نتائج أكثر قابلية للتناسب عبر الأنواع [39]. لا تزال هناك حاجة ماسة للدراسات التي تستند إلى البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام نفس منهجية قياس التيلومير والتحليل أثناء التحكم في التطور النسبي [9،40].

(1) كانت فرضيتنا الرئيسية هي أن معدلات فقدان التيلومير مرتبطة بأقصى عمر للأنواع ، بحيث يكون لتلك الأنواع ذات معدلات تآكل التيلومير الأبطأ أيضًا عمرًا أطول أطول [35]. بسبب الطبيعة المقارنة لهذه الدراسة ، قد يكون سبب أنماط طول التيلومير وعمره في مجتمع أو نوع ما هو الاختفاء الانتقائي للأفراد ذوي التيلوميرات القصيرة [41] ونحن نناقش هذا أيضًا.

(2) ذكرت دراسة مقارنة حديثة باستخدام تحليلات علم الوراثة لأكثر من 60 نوعًا من الثدييات أن متوسط ​​طول التيلومير لأحد الأنواع يرتبط عكسيًا بعمر [11]. على حد علمنا ، لم يتم اختبار هذه العلاقة بعد في دراسة يتم التحكم فيها عن طريق التطور الوراثي للطيور.

(3) فرضية حافة الهاوية التيلوميرية [42] تفترض دورًا سببيًا لتقصير التيلومير في تشكيل طول العمر. إذا كانت التيلوميرات القصيرة للغاية تزيد من خطر الوفاة ، فإن النتيجة الطبيعية لهذه الفرضية هي أن الأنواع ذات أطوال التيلومير المتوسطة الأقصر ومعدلات فقدان التيلومير الأسرع يجب أن يكون لها أيضًا عمر أقصر ، وهو ما نختبره هنا.

(4) فرضية حديثة أخرى في بيولوجيا التيلومير هي أن التيلوميرات الطويلة تقصر بسرعة أكبر من التيلوميرات القصيرة ، ربما لأن التيلوميرات الأطول تكون أكثر حساسية لأحداث تلف التيلومير [26]. على حد علمنا ، تم تقييم هذه الفرضية فقط داخل الأنواع ، واختبرنا ما إذا كان هناك أي دعم عبر أنواع الطيور.

2. الطرق

(أ) الأنواع

استكشفنا تقصير التيلومير في عينات الدم المقطعية من 19 نوعًا من الطيور تمثل 5 أوامر (الجدول 1 والشكل 1). لقد اخترنا الأنواع التي كانت متاحة فيها مجموعات الدراسة طويلة الأجل مما سمح لنا بأخذ عينات من الأفراد على مدى واسع من الحد الأقصى لعمرهم المتوقع (الجدول 1). تتراوح تقديرات العمر الأقصى لهذه الأنواع من 7 إلى 50 عامًا ، واستندت إلى مجموعات الدراسة الطبيعية طويلة الأجل. كان الجنس غير معروف بالنسبة لعدد كبير من الأفراد في العديد من الأنواع ، وبالتالي ، لم يتم تضمين الجنس في التحليل. نحن ندرك أن التحيز المحتمل في نتائجنا قد ينشأ من الفروق بين الجنسين في معدل الوفيات لأن الذكور والإناث غالبًا ما يختلفون في معدل الوفيات والعمر [48] ويمكن أيضًا أن تختلف معدلات استنزاف التيلومير حسب الجنس [49]. نظرًا لعدم معرفة الجنس ، تم استخدام متوسط ​​العمر الأقصى بين الذكور والإناث في تحليلاتنا. في حين أنه قد يكون هناك بعض الخطأ في تقديرات العمر الأقصى ، لا نعتقد أنه سيكون كافياً لتغيير استنتاجاتنا. على الرغم من أن بعض الدراسات قد اقترحت أن متوسط ​​أو متوسط ​​العمر قد يعكس الاختلافات في عملية الشيخوخة بشكل أكثر دقة ، إلا أن هذه القيم لم تكن متاحة لجميع الأنواع. بالإضافة إلى ذلك ، سمحت لنا تقديرات العمر الأقصى أن تكون متسقة مع الدراسات السابقة [35-37].

الشكل 1. طول التيلومير (من الدم الكامل المقاس بواسطة تحليل TRF) كدالة للعمر في 19 نوعًا من الطيور المدرجة في التحليل المقارن. الخطوط هي انحدارات خطية ، وتم استخدام منحدر خط الانحدار لطول التيلومير مقابل العمر كمعدل تغير التيلومير (TROC). منحدر الانحدار وخطأه المعياري و ص 2 تتم طباعتها داخل لوحة كل نوع.

الجدول 1. تقديرات مقطعية لمعدل تغير التيلوميرات في خلايا الدم (TROC) من 19 نوعًا من الطيور تمت دراستها (بما في ذلك الترتيب والعائلة) ، وأقصى عمر لوحظ (مع مراجع أدبية) وكتلة الجسم. يتم تضمين حجم العينة (عدد الأفراد) لكل نوع جنبًا إلى جنب مع نطاق الأعمار التي تم أخذ عينات منها. * اتصال شخصي من DWW ، 2011.

(ب) طرق المختبر

تم قياس جميع العينات التي تم تحليلها في هذه الدراسة باستخدام مقايسة TRF باتباع المنهجية المحددة مسبقًا [26،50،51]. تم تطوير اختبار TRF منذ أكثر من 25 عامًا ولا يزال يستخدم على نطاق واسع للتحقق من صحة تقنيات قياس التيلومير الأخرى [39]. يستخدم الاختبار هضم إنزيم التقييد للحمض النووي الجيني متبوعًا بالتهجين الجنوبي إلى مسبار مشع يحتوي على تكرار طرفي لقياس متوسط ​​طول التيلومير من توزيع TRFs. يحتوي اختبار TRF التقليدي على بعض العيوب ، من بينها أنه إلى جانب التكرارات التيلوميرية الطرفية ، فإنه يقيس أيضًا التيلوميرات الخلالية ويتحيز ضد اكتشاف التيلوميرات القصيرة. البديل من هذا ، اختبار TRF في هلام الذي استخدمناه هنا ، يحل كلتا هاتين المسألتين من خلال التحقيق فقط في البروز القصير G-strand [39،52]. من المهم ملاحظة أنه تم قياس قياسات التيلومير لـ 17 نوعًا من أصل 19 نوعًا في مختبر واحد (MFH) ، بينما تم قياس النوعين المتبقيين (Haematopus ostralegus و باروس الكبرى) بمنهجية متسقة معتمدة من المختبر المذكور أعلاه. إزالة هذين النوعين من التحليل لا يغير أي من النتائج التالية. بالإضافة إلى الاتساق داخل تقنية TRF ، من المعروف أن طرق أخذ عينات الدم وتخزينها واستخراج الحمض النووي تؤثر على تقديرات طول التيلومير [39]. في ضوء ذلك ، استخدمنا بروتوكولات تخزين واستخراج متسقة ، وإذا تم إجراء تغييرات صغيرة ، فقد تمكنا من التحقق من صحة ذلك ، ضمن مجموعة العينات هذه ، لم يؤثر ذلك على قياس التيلومير. للحصول على منهجية محددة حول اختبار TRF داخل الجل المستخدم في هذه الدراسة ، انظر Haussmann وآخرون. [51].

(ج) تحليل طول التيلومير

تم تصوير المواد الهلامية من جميع الأنواع الـ 17 على شاشة الفوسفور باستخدام مصور Typhoon Variable Mode (أميرشام بيوسينسز ، باكينجهامشير ، المملكة المتحدة) لتصور التيلوميرات. تتوافق كمية الإشارة المشعة (الكثافة الضوئية ، OD) في كل حارة مع كمية التيلومير في هذا الموضع على الهلام (i) ، وتم قياسها بواسطة قياس الكثافة في ImageJ (الإصدار 1.51). تم طرح إشارة الخلفية من الارتباط غير المحدد للمسبار المشع من جميع مقاييس OD.اختلفت العلامات الجزيئية المحددة على كل هلام لأنه تم تحسين ظروف الهلام بناءً على توزيع التيلومير الخاص بالنوع (1 كيلو بايت سلم DNA (1-10 كيلو بايت) 1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم DNA (1-12 كيلو بايت) Lambda DNA / EcoR1 + HindIII ( 1-21 كيلو بايت) 1 كيلو بايت سلم تمديد DNA (1-4 0 كيلو بايت) ، Invitrogen λ DNA Monocut (2-49 كيلو بايت) نيو إنجلاند Biolabs DNA Marker XV (2–49 كيلو بايت) ، Roche PFG Marker 1 (15-200 كيلو بايت) ، New England Biolabs). ومع ذلك ، وبغض النظر عن العلامة الجزيئية المستخدمة ، تم رسم المسافة التي تنتقل بها كل مجموعة من الواسم الجزيئي (i) مقابل الوزن الجزيئي في قواعد الكيل وتحويلها إلى أوزان جزيئية (L) باستخدام دالة لوغاريتمية خطية ثلاثية المعلمات. تم حساب متوسط ​​طول TRF (يسمى متوسط ​​طول التيلومير فيما بعد للبساطة) لكل فرد باستخدام: متوسط ​​TRF = ∑ (ODi * LI) / ∑ (ODi) ، حيث ODi هو ناتج قياس الكثافة في الموضع i ، و Li هو الطول من DNA (kB) في الموضع I [52].

(د) التحليل الإحصائي

لكل نوع ، قمنا بتقدير معدل تغير التيلومير الخاص بالأنواع (TROC ، bp yr −1) كمنحدر لخط الانحدار الخطي لطول التيلومير مقابل العمر [35]. لقد فعلنا ذلك لأنه بينما حاولنا أخذ عينات على نطاق واسع عبر النطاق العمري لكل نوع ممكن (الجدول 1) ، كنا مقيدًا بما كان متاحًا. وهكذا ، قمنا بافتراض إرشادي لمعدل خطي لفقدان التيلومير عبر جميع الأعمار لأنه سمح بتقديرات غير متحيزة لـ TROC بسبب الاختلافات في نطاق عمر الأنواع التي تم أخذ عينات منها. بينما تشير الدراسات الطولية إلى أن معدل فقد التيلومير يكون أسرع في وقت مبكر من الحياة [40] ، ومن المثير للاهتمام ، أننا لم نلاحظ انحرافات واضحة عن هذا الافتراض (الشكل 1) ولكن مع توفر المزيد من البيانات المقارنة للتيلومير لطول التيلومير (TL) ، يجب أن تكون العلاقات غير الخطية يمكن استكشافها. تم تقييم الاختلافات بين متوسط ​​طول التيلومير للأنواع و TROC في نموذج خطي. تم تقييم العلاقات بين طول التيلومير أو TROC مع أقصى عمر بين الأنواع باستخدام التحليل المقارن.

في التحليل المقارن ، ينتهك الأصل المشترك افتراض الاستقلالية بين نقاط البيانات ، بما في ذلك معلومات النشوء والتطور الحسابات إحصائيًا لمثل هذا الاعتماد. تحقيقًا لهذه الغاية ، تم تحليل الانحدارات المصححة نسبيًا باستخدام المربعات الصغرى المعممة بافتراض بنية ارتباط براونية في حزمة القرد في R [53]. تم استخراج السلالة التي استخدمناها من شجرة طائر عالية [54]. تم اختيار الشجرة الأكثر شحًا من توزيع بايزي لألف شجرة باستخدام BEAST [55]. لذلك فإن نماذجنا لا تتضمن الارتياب في علم الوراثة [56]. تم تحليل إشارة النشوء والتطور - مقدار التباين بين الأنواع التي أوضحها الأصل المشترك [57] - في كل من TROC ومتوسط ​​TL في أدوات نباتية [58]. كلا Pagel's λ و Blomberg's K تم اختبارهما (مع تقديم K فقط ، حيث أسفر كلاهما عن نتائج مماثلة [59]). تم رسم تطور السمات على تطور السلالات النباتية في أدوات نباتية [58] في R.

تركزت فرضيتنا الرئيسية على ما إذا كان وكيف يرتبط TROC بأقصى عمر عبر الأنواع (الفرضية الأولى). ومع ذلك ، اكتشفنا أيضًا ما إذا كان متوسط ​​طول التيلومير مرتبطًا بأقصى عمر عبر الأنواع ، كما هو الحال في الثدييات (الفرضية الثانية [11]). تحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بتركيب عدة نماذج حول هذه المتنبئات ، وقمنا أيضًا بتضمين كتلة الجسم كمتغير مشترك [60]. كتلة الجسم (log10-transformed) بسبب الارتباط الواضح بين كتلة الجسم وطول العمر [61]. كان متوسط ​​طول التيلومير و TROC لوغاريتمي10- تحول قبل التحليل. زاد طول التيلومير مع تقدم العمر في نوعين (H. ostralegus و أوشيانودروما ليوكورهوا) ، مما أدى إلى TROC سالب ، وبالتالي تم تسجيل قيم TROC10 (x + 100) - تحول. سمح لنا تضمين هذه المتغيرات المشتركة أو إزالتها بالتحقيق في أي حساسية لنتائجنا لتعني طول التيلومير وكتلة الجسم ، لكن النتائج كانت متشابهة في جميع النماذج. نحن نفضل عرض النماذج الكاملة بدلاً من اختيار النموذج ، حيث تُظهر النماذج الكاملة النطاق الكامل للمتنبئين الذين تم فحصهم (كلاهما مهم وغير مهم) وليس من المرجح أن يضخم الخطأ من النوع الأول [62].

بالإضافة إلى ذلك ، سمحت لنا مجموعة البيانات المقارنة الخاصة بنا باختبار فرضيتين محددتين أخريين معروضين في الأدبيات. أولاً ، درسنا فرضية حافة الهاوية التيلوميرية (الفرضية الثالثة [42]) ، والتي تشير إلى أن تقصير التيلومير هو سبب في عملية الشيخوخة ، وعندما تصبح التيلوميرات قصيرة جدًا فإنها تسبب الموت. هنا ، التوقع هو أن الأنواع ذات متوسط ​​طول التيلومير القصير ومعدلات تقصير التيلومير الأسرع سيكون لها أيضًا عمر أقصر أقصر. إذا كانت هذه العلاقة موجودة في البيانات ، فيجب أن يؤدي ذلك إلى تفاعل بين متوسط ​​TL و TROC مقابل أقصى عمر للأنواع. ثانيًا ، قمنا باختبار التنبؤ بأن الأنواع ذات التيلوميرات الأطول قد تظهر تقصيرًا أسرع للتيلومير ، وهو ما تم اقتراحه سابقًا داخل الأنواع (الفرضية الرابعة [63]). لقد أجرينا انحدارًا نسبيًا لمتوسط ​​TL مقابل TROC ، حيث تشير العلاقة الإيجابية إلى أن تلك الأنواع ذات التيلوميرات الأطول تُظهر أيضًا فقدانًا أسرع للتيلوميرات.

3. النتائج

اختلف متوسط ​​طول التيلومير و TROC اختلافًا كبيرًا بين الأنواع (الشكل 1 ، النموذج الخطي: كلاهما ص & lt 0.0001). تظهر بعض الأنواع انخفاضًا حادًا في طول التيلومير مع تقدم العمر ، بينما يزداد البعض الآخر مع تقدم العمر. ومن المثير للاهتمام ، أن TROC ارتبطت ارتباطًا وثيقًا بالعمر الأقصى عبر الأنواع ، مع الأنواع ذات الأعمار القصوى الأقصر التي لها أكبر قدر من TROC (الشكل 2أ، الفرضية ط). هذه العلاقة قوية لإدراج المتغيرات المشتركة المختلفة التي تم اختبارها (الجدول 2). لم تكن هناك علاقة بين متوسط ​​طول التيلومير لأحد الأنواع وأقصى عمر (الجدول 2 والشكل 2ب، الفرضية الثانية). بالإضافة إلى ذلك ، لم يكن التفاعل بين متوسط ​​طول التيلومير و TROC مقابل الحد الأقصى للعمر المحدد للأنواع مهمًا (الفرضية الثالثة ، التفاعل: −0.60 ± 0.55 ص = 0.29 أيضًا بدون تضمين كتلة الجسم ، ص = 0.21) ، مما يشير إلى أن TROC ليس أكثر تحديدًا للعمر الأقصى للأنواع في الأنواع ذات أطوال التيلومير المطلقة القصيرة. لم يكن TROC أيضًا مرتبطًا بمتوسط ​​طول التيلومير للأنواع (الجدول 2 والشكل 2ج، الفرضية الرابعة).

الشكل 2 - الحد الأقصى للعمر الملحوظ كدالة لـ (أ) معدل تغير التيلومير (TROC) و (ب) يعني طول التيلومير في 19 نوعًا من الطيور. (ج) متوسط ​​طول التيلومير الذي تم رسمه مقابل TROC في 19 نوعًا من الطيور. تمثل الخطوط المتقطعة الانحدارات من الانحدارات التطورية دون أي متغيرات مشتركة أخرى مدرجة.

الجدول 2. اختبارات الفرضيتين الأوليين (انظر §§1،2) في الانحدار المصحح نسبيًا (* يشير إلى ص & lt 0.05 ، ± تشير إلى s.e.). تم اختبار النماذج مع وبدون كتلة الجسم (log10-التحويل) كمتغير مشترك ، وبمتوسط ​​طول التيلومير وبدونه كمتغير مشترك. معدل تغير التيلومير (TROC) هو المتنبئ الوحيد المهم والقوي للتغير الأقصى في العمر بين الأنواع ، مع ارتفاع معدلات فقدان التيلومير المرتبطة بعمر أقصر أقصر (الفرضية 1). لم يكن TROC متعلقًا بمتوسط ​​طول التيلومير لأحد الأنواع (الفرضية الثانية).

تم الكشف عن إشارة النشوء والتطور لـ TROC (ك = 1.21, ص & lt 0.001 الشكل 3) ، ولكن ليس لطول التيلومير المطلق (ك = 0.35, ص = 0.60). لاحظ أن متى ك أكبر من 1 يشير إلى أن الأنواع ذات الصلة بالتطور الوراثي أكثر تشابهًا مما كان متوقعًا في ظل الحركة البراونية [59].

الشكل 3. تطور السمات لمعدل تغير التيلومير (TROC) المعين إلى نسالة 19 نوعًا من الطيور. تشير الألوان إلى مستويات مختلفة من قيمة السمة (تم استخدام القيم المحولة لرسم الخرائط ، ولكن تم توضيح القيم الخطية لأغراض توضيحية في وسيلة الإيضاح). تُظهر TROC إشارة سلالة قوية وتظهر العائلات أو مجموعات الأنواع الرئيسية التي تم تضمينها في هذا التحليل معدلات مماثلة لفقدان التيلومير مع تقدم العمر.

4. مناقشة

تؤكد دراستنا التقارير السابقة التي تفيد بأن الأنواع التي تحتوي على نسبة أكبر من TROC لها عمر أقصر أقصر (الفرضية الأولى [35-37]). على النقيض من ذلك ، من بين الأنواع التي تم أخذ عينات منها هنا ، لم يكن متوسط ​​طول التيلومير مرتبطًا بطول العمر (الفرضية الثانية). نظرًا لأن TROC يشرح بدقة أقصى عمر (الجدول 2 ، الشكل 2) ، فإن الأسباب الفسيولوجية لتقصير التيلومير ، أو القدرة على الحفاظ على التيلوميرات ، يمكن أن تكون مسؤولة جزئيًا عن الأعمار المختلفة التي لوحظت عبر الأنواع. دعماً لهذا الاقتراح ، يُظهر TROC إشارة نسل قوية ، في حين أن طول التيلومير المطلق لا يفعل ذلك ، على الرغم من أنه يختلف بشكل كبير بين الأنواع. لذلك ، يبدو TROC ، على عكس طول التيلومير المطلق ، محفوظًا ومختارًا من الناحية التطورية داخل عائلات الطيور. نحن ندرك أن هذا الاستدلال يكون أقل ثباتًا عندما تكون السلالات صغيرة ، ولكن الفرق في إشارة النشوء والتطور يكون مدهشًا عند النظر في الأهمية البيولوجية المحتملة لفقدان طول التيلومير مقارنة بطول التيلومير المطلق.

قد يكون النمط المذكور هنا بين TROC والعمر ناتجًا جزئيًا عن الاختفاء الانتقائي ، حيث يتم إزالة أنماط ظاهرية معينة بشكل تفضيلي من السكان [41]. نظرًا لأن دراستنا ذات طبيعة مقطعية نظرًا لعدم وجود مجموعات الدراسة طويلة الأجل والعمر الطويل لبعض الأنواع ، يمكن أن تكون العلاقة بين TROC والعمر نتيجة لفقدان انتقائي للأفراد قصير العمر من البيئة. هذا الاختفاء الانتقائي لأفراد معينين [41،64] - أولئك الذين لديهم تيلوميرات قصيرة - يمكن أن يطغى على العلاقة بين فقدان التيلومير والعمر في سياق المقطع العرضي [65]. على سبيل المثال ، العلاقة الإيجابية بين طول التيلومير والعمر في عاصفة ليتش (O. leucorhoa) على الأرجح بسبب الأفراد الأطول عمرًا بدءًا من التيلوميرات الأطول والتباين في طول التيلومير يتناقص مع تقدم العمر بسبب الاختفاء الانتقائي للأفراد ذوي التيلوميرات القصيرة [65]. من الممكن أيضًا أن يكون الاختفاء الانتقائي مسؤولاً عن العلاقة الإيجابية التي شوهدت في صائد المحار الأوراسي (H. ostralegus). من الصعب ترجمة نمط المقطع العرضي داخل الأنواع إلى العمليات الفردية لتلك الأنواع. ستسمح لنا الدراسات الطولية المستقبلية بالتمييز بين الفروق السكانية الناتجة عن إزالة أنماط ظاهرية معينة في وقت مبكر من الحياة أكثر من غيرها. في الوقت الحالي ، تعد الدراسات الطولية للشيخوخة في المجموعات السكانية التي تعيش بحرية أمرًا نادرًا ، ولكنها ضرورية نظرًا لقدرتها الأكبر على تحديد التغيرات المرتبطة بالعمر مقارنة بالدراسات المقطعية [31،66،67]. ومع ذلك ، في سياق مقارن ، لا يزال بإمكان الدراسات المستعرضة أن تخبرنا على نطاق واسع ببيولوجيا الشيخوخة والعمر ، على الرغم من أننا نفقد القدرة على الاستنتاج بحزم أن هذه الأنماط ناتجة عن عمليات داخل الأفراد.

الدرجة التي يختلف فيها الاختفاء الانتقائي بين الأنواع يمكن أن يكون سببها الاختلافات في معدلات الوفيات الخارجية والاختلافات في كيفية تأثر الوفيات المرتبطة بالعمر ببيولوجيا التيلومير. تتنبأ النظريات التطورية الكلاسيكية للشيخوخة بأن مستويات الوفيات الخارجية يجب أن ترتبط عكسياً مع تطور العمر [68]. بعبارة أخرى ، تواجه الأنواع قصيرة العمر عمومًا مخاطر أعلى للوفاة بسبب الافتراس أو الجوع أو الحوادث. بالنظر إلى هذا ، فإن أحد التفسيرات لنتائجنا هو أنه إذا كان هناك اختفاء انتقائي للأفراد ذوي التيلوميرات القصيرة ، فقد يتم إخفاء هذا النمط جزئيًا في مجموعات الأنواع حيث يتم إزالة الأفراد من السكان بسبب عمليات عشوائية بغض النظر عن حالتهم. هذا لا يعني أن الاختفاء الانتقائي القائم على طول التيلومير لا يحدث في الأنواع قصيرة العمر ، فقط لأنه قد يتم حجبه بسهولة أكبر. على العكس من ذلك ، إذا أدى تآكل التيلومير في الواقع إلى زيادة مخاطر الوفيات ، فقد يتوقع المرء أن يكون هذا أكثر وضوحًا في الأنواع طويلة العمر ذات معدلات الوفيات الخارجية المنخفضة حيث يمكن ملاحظة الشيخوخة الوظيفية بسهولة أكبر. إذا كانت اختلافات الوفيات الخارجية هي المحرك الرئيسي للاختفاء الانتقائي بناءً على طول التيلومير ، فقد يفسر هذا سبب كون الأنواع التي تعرض أنماطًا تشبه إلى حد كبير الاختفاء الانتقائي هما من الأنواع الأطول عمراً التي درسناها ، وهما طائر النوء والمحار.

ومع ذلك ، بغض النظر عن اختلافات الأنواع في الوفيات الخارجية ، فإن الدرجة التي تؤثر بها بيولوجيا التيلومير على عمليات الشيخوخة الذاتية قد تختلف أيضًا عبر الأنواع ، مما يؤثر على الاختفاء الانتقائي. بعبارة أخرى ، قد يكون لبعض الأنواع علاقة أقوى بين بيولوجيا التيلومير واحتمالات البقاء على قيد الحياة مقارنة بالآخرين. وبالتالي ، يمكن أن يكون الاختفاء الانتقائي أقوى في الأنواع طويلة العمر والتي تعتبر بيولوجيا التيلومير أكثر أهمية بالنسبة لها. لذلك ، قد يكون الاختفاء الانتقائي ناتجًا عن كل من الارتباط التفاضلي للوفيات الجوهرية بطول التيلومير والاختلافات في الوفيات الخارجية التي تقلل من أهمية طول التيلومير في تحديد معدل الوفيات على مستوى السكان. بغض النظر عن أي من هذه الأسباب ، فإن النمط المقارن الذي نجده يشير إلى أنه مع زيادة طول عمر نوع ما ، تزداد أهمية بيولوجيا التيلومير. من الآن فصاعدًا ، هناك حاجة ماسة إلى مزيد من البيانات الطولية لفك تشابك السيناريوهات المحتملة الموضحة أعلاه والتي يمكن أن تؤدي إلى العلاقة المقطعية التي نبلغ عنها هنا. ستسمح لنا هذه الجهود بفهم المزيد من التفاصيل عن عملية تدهور الشيخوخة بشكل عام [67] ، وكيف يحدث الاختفاء الانتقائي في الأنواع ذات الأعمار المختلفة على وجه الخصوص.

في حين أن الاختفاء الانتقائي قد يكون مسؤولاً جزئياً عن النمط الذي نلاحظه بين TROC والعمر ، فإن الاحتمال الآخر هو أن تآكل التيلومير هو آلية محتملة تكمن وراء تطور العمر الافتراضي للطيور ، حيث تفقد الطيور قصيرة العمر المزيد من التيلوميرات كل عام مقارنة بالطيور طويلة العمر. الطيور. أفاد تحليل تلوي حديث لـ 14 نوعًا من الطيور أن معدل فقدان التيلومير مرتبط بأقصى عمر مقدّر من مقياس مركب لصفات تاريخ الحياة [36]. أكدت دراسة حديثة أخرى ، باستخدام البيانات الموجودة من الدراسات الطولية على أنواع الطيور ، وجود علاقة سلبية بين معدل تقصير التيلومير وطول العمر الأقصى [37]. توفر كلتا الدراستين الأخيرتين دعمًا إضافيًا للفرضية القائلة بأن استنزاف التيلومير مرتبط بمعدلات الشيخوخة بين الأنواع. لا تزال الآليات الأساسية المسؤولة عن هذه العلاقة غير معروفة ، والاختفاء الانتقائي ، والآليات الفسيولوجية التي تخفف من فقدان التيلومير ، أو مزيج من الاثنين قد يلعب دورًا.

بحثًا عن الآليات الفسيولوجية التي تكمن وراء تطور العمر ، كشفت التحليلات المقارنة أنه عبر أنواع الطيور والثدييات ، فإن تلك الأنواع ذات الأعمار الأطول تمتلك أيضًا خلايا أكثر مقاومة للضغوط الخارجية [69] ولديها معدلات أقل من الجذور الحرة للميتوكوندريا جيل [70]. أحد التفسيرات الفسيولوجية المحتملة للمعدلات المختلفة لفقدان التيلومير في أنواع الطيور في دراستنا هو أن لديهم أيضًا مستويات مختلفة من الإجهاد التأكسدي. يمكن أن يزيد الإجهاد التأكسدي من الفواصل المفردة التي تقطعت بها السبل في مناطق التيلومير من الحمض النووي التي يمكن أن تسبب تقصير التيلومير أثناء تكرار الحمض النووي بسبب الإيقاف المؤقت المقترح لشوكة النسخ [13] ، على الرغم من أن هذا العمل يعتمد بشكل أساسي على في المختبر الدليل ، وما إذا كان يحمل في الجسم الحي تم استجوابه مؤخرا [71]. ومع ذلك ، فإن الأنواع ذات المستويات الأعلى من الإجهاد التأكسدي قد تعاني من تقصير التيلومير السريع. ومن المثير للاهتمام ، أن هذا قد يرجع جزئيًا إلى الضرر التفضيلي للجذور الحرة للتسلسل التيلومري الغني بالجوانين مقارنة بمناطق أخرى من الحمض النووي [72]. قد يسمح هذا للتيلوميرات بالعمل كمغناطيس للجذور الحرة ، وامتصاص الجذور الحرة الضارة مع حماية مناطق الترميز في الكروموسوم. وفقًا لذلك ، إذا كانت الأنواع طويلة العمر تعاني من مستويات أقل من الإجهاد التأكسدي ، فإن التيلوميرات الخاصة بها قد تكون أقل تعرضًا للهجوم الضار للجذور الحرة.

آلية أخرى يمكن أن تكمن وراء العلاقة بين معدل فقدان التيلومير وأقصى عمر للأنواع هي المستويات التفاضلية لتعبير التيلوميراز. في الثدييات ، وجدت المقارنة التي يتم التحكم فيها نسبيًا في القوارض أن نشاط الإنزيم تيلوميراز مرتبط بكتلة الجسم [33]. أكدت دراسة مقارنة أخرى للثدييات العلاقة بين نشاط التيلوميراز وكتلة الجسم ووجدت أيضًا علاقة عكسية بين متوسط ​​طول التيلومير والعمر [11]. يقترح مؤلفو الدراسة أن التيلوميرات القصيرة جنبًا إلى جنب مع كبت التيلوميراز ضروريان لتطور حجم الجسم الكبير وطول العمر في الثدييات ، على ما يبدو كآلية لقمع السرطان. ومن المثير للاهتمام ، في حين أن متوسط ​​طول التيلومير يختلف حسب ترتيب الحجم في الأنواع التي درسناها (5-50 كيلو بايت) ، فإننا لا نجد علاقة بين متوسط ​​طول التيلومير والعمر (الفرضية الثانية). قد يشير الافتقار إلى إشارة النشوء والتطور إلى أن طول التيلومير يتطور بسرعة ضمن السلالة ، على الرغم من أن هذا السيناريو غير مرجح لأن التحليل يتضمن بعض الأنواع وثيقة الصلة (القُّمّة و تاتشيسينيتا أزواج الأنواع ، على سبيل المثال). الاحتمال الآخر هو أن تقصير التيلومير أكثر أهمية في كروموسومات معينة ، لكن هذا الاختيار محايد للكروموسومات الأخرى. تساهم كل نهاية كروموسوم في متوسط ​​طول التيلومير لأحد الأنواع باستخدام اختبار TRF داخل الهلام ، ويمكن أن تحدد طرق مثل تحليل طول التيلومير الفردي بشكل أفضل الدور الذي قد يلعبه طول التيلومير في نهايات الكروموسوم الفردي في العمر الافتراضي.

أظهرت الدراسات السابقة على الطيور مستويات أعلى من التعبير عن الإنزيم تيلوميراز في خلايا الأنواع ذات الأعمار القصوى الأطول [73]. يشير هذا إلى أن أنواع الطيور ذات العمر الأطول قد تكون قد طورت آليات تعزز الحفاظ على التيلومير من خلال تعبير التيلوميراز. بالمقارنة مع الثدييات ككل ، فإن الطيور قد قللت من كتلة الجسم وأطول عمرًا نسبيًا. وتم اقتراح فكرة أن حجم الجسم الأصغر وعدد الخلايا الأقل قد يسمح للطيور بأن يكون لها نشاط تيلوميراز أعلى وتيلوميرات أطول دون التعرض لخطر الإصابة بالسرطان [40]. في حين أن هذه الفكرة مثيرة للاهتمام ، إلا أن هناك حاجة ماسة إلى مزيد من العمل الخاضع للتحكم في علم الوراثة على التباين بين الأنواع في تعبير التيلوميراز وكذلك العمل التجريبي المقارن على نشاط التيلوميراز في الخلايا السرطانية.

لا يزال الدور المباشر للتيلوميرات في شيخوخة الكائن الحي غير واضح [22]. في حين أن تقصير التيلومير قد يساهم بشكل مباشر في الشيخوخة [76] ، فقد لا توجد أيضًا علاقة سببية بين بيولوجيا التيلومير والشيخوخة [22،77]. في الآونة الأخيرة ، افترضت فرضية حافة الهاوية التيلوميرية (الفرضية الثالثة [42]) دورًا سببيًا لتقصير التيلومير في تشكيل طول العمر. على وجه التحديد ، لاحظ المؤلفون أن الأفراد الذين يولدون بتيلوميرات قصيرة لديهم أيضًا تيلوميرات أقصر في مرحلة البلوغ ، مما يؤدي إلى درجة أكبر من الشيخوخة الخلوية والوفيات ، وربما من خلال تصلب الشرايين.اختبرنا هذه الفرضية في دراستنا المقارنة للطيور ، لكننا لم نجد علاقة أقوى بين TROC وأقصى عمر للأنواع ذات أطوال التيلومير القصيرة. بالنظر إلى أن تصلب الشرايين شائع نسبيًا في أنواع الطيور [78] ، فإن هذا يثير احتمال أن التيلوميرات قد لا تلعب دورًا سببيًا في الشيخوخة ، بل تعمل كمؤشر بيولوجي لعلم وظائف الأعضاء الأخرى المرتبطة بالشيخوخة [18،69]. ومع ذلك ، فإن البيانات التي تستكشف فقدان التيلومير على مدى عمر الفرد داخل الأنواع ضرورية لتقييم هذه الفرضية بشكل أفضل. من الفرضيات الحديثة الأخرى في بيولوجيا التيلومير أن التيلوميرات الطويلة تقصر بسرعة أكبر من التيلوميرات القصيرة ، ربما لأن التيلوميرات الأطول تكون أكثر حساسية لأحداث تلف التيلومير أو حتى تلف الحمض النووي العشوائي (الفرضية الرابعة [26،79]). على حد علمنا ، تم تقييم هذا فقط داخل الأنواع ، ولكن عبر الأنواع لم نجد دعمًا لهذه الفرضية. ولكن ، في حين أننا قد نتوقع أن تفقد الأنواع ذات متوسط ​​طول التيلومير الأطول التيلوميرات بسرعة أكبر ، لا يمكننا تفسير الاختلافات في آليات صيانة التيلومير بين الأنواع ، مما قد يؤدي إلى حجب هذه العلاقات.

5. الخلاصة

يمكن المساعدة في تحديد الأهمية التطورية لكيفية تسبب الآليات الفسيولوجية المختلفة في عملية الشيخوخة من خلال الدراسات المقارنة. تظهر نتائج هذه الدراسة بوضوح أن معدلات فقدان التيلومير ترتبط ارتباطًا وثيقًا بطول عمر الأنواع في الطيور. بالإضافة إلى ذلك ، يتم الحفاظ على هذه العلاقة تطوريًا واختيارها ضمن عائلات الطيور. قد تواجه أنواع الطيور التي تتمتع بقدرة أفضل على الحفاظ على التيلوميرات الخاصة بها أو العكس التي ترتبط التيلوميرات ارتباطًا وثيقًا بالبقاء على قيد الحياة ، مما يتسبب في اختفاء انتقائي ، بمعدلات أقل من الشيخوخة الخلوية والعضوية. بينما تسلط هذه الدراسة الضوء على العلاقة بين بيولوجيا التيلومير ووتيرة الحياة بين الأنواع ، نحتاج إلى الاستمرار في الكشف عن كيفية ارتباط العمليات الفردية التي تؤثر على الشيخوخة في الخلفية البيئية المتغيرة باستمرار بفقدان التيلومير.

أخلاق مهنية

تم إجراء جميع الإجراءات بموافقة لجنة أخلاقيات الحيوان المحلية المناسبة.


2 طرق

قمنا بتحديد أطوال التيلومير في ذكور التنانين المرسومة (Ctenophorus pictus) من أربعة أشكال مختلفة من لون الرأس (الشكل 1). تعتبر التنانين نماذج مثالية لهذا البحث لأنها قصيرة العمر وتتقدم في العمر بسرعة (على قيد الحياة

عام واحد في البرية ، Olsson ، Healey ، Wapstra et al. ، 2007) ، مما يزيد من احتمالية اكتشاف محاولات التلاعب بالتيلوميرات (Olsson، Tobler، Healey، Perrin، Wilson، 2012).

تم تنفيذ هذا العمل بموجب تصريح أخلاقيات الحيوان 2013/6050 في جامعة سيدني. ناضجة (

9 أشهر) تم القبض على السحالي الذكور عن طريق حبل المشنقة أو باليد في محمية ياثونغ الطبيعية ، نيو ساوث ويلز ، أستراليا (145 درجة 35 شرقا 32 درجة 35 درجة جنوبا) وتم نقلها إلى مرافق احتجاز في جامعة سيدني في أكتوبر 2014 حيث تم إيواؤهم من أجل مدة التجارب. تم إيواء الذكور البالغين بشكل فردي في أحواض بلاستيكية غير شفافة (330 × 520 × 360 مم) مع ركيزة رملية وتعرضوا لضوء مدته 12 ساعة: دورة إضاءة داكنة لمدة 12 ساعة. تم إيواء الذكور في ثلاث غرف مختلفة لأسباب لوجستية ، ولكن تم توزيع الأشكال العشوائية بين الغرف. تم إطعام السحالي ديدان الوجبة والصراصير ، وغبارها بالكالسيوم والفيتامينات المتعددة ، لإشباعها كل يوم وتم رش الأقفاص بالماء مرة واحدة في اليوم. تم توفير مصابيح الحرارة والجلود الخزفية للسماح للسحالي بالتنظيم الحراري لدرجة حرارة الجسم المفضلة (36 درجة مئوية MO ، بيانات غير منشورة تم الحصول عليها من قراءات درجة حرارة المذرق في البرية).

2.1 أخذ عينات الدم

150 ميكرولتر) باستخدام أنبوب شعري قبل وبعد الانتهاء من العلاج عن طريق تمزيق الوريد الزاوي (في زاوية الفم) برأس حقنة. تم خلط الدم الذي تم جمعه مع الهيبارين والطرد المركزي ، وإزالة البلازما وتعليق الخلايا المتبقية مع 200 ميكرولتر من PBS. تمت إضافة مليلتر واحد من RNAlater (Sigma Aldrich ، أستراليا) وتم تخزين محلول خلايا الدم المخفف لـ qPCR فورًا عند درجة حرارة -80 درجة مئوية.

2.2 قياس طول التيلومير: qPCR

لتحليل طول التيلومير ، قمنا أولاً بتنقية الحمض النووي من 50 ميكرولتر من استخدام DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen ، أستراليا) ، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تمت إضافة RNase A (Qiagen ، أستراليا) بالتركيز الموصى به. تم قياس تركيز الحمض النووي (نانوغرام / ميكرولتر) لكل عينة في نسختين باستخدام Pherastar FS (BMG ، Labtech ، ألمانيا) وقسامات مخففة إلى 10 نانوغرام / ميكرولتر باستخدام المخزن المؤقت AE المقدم في مجموعة استخراج الحمض النووي. ثم تم تخزين العينات عند -30 درجة مئوية. تم قياس طول التيلومير باستخدام PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR) باستخدام SensiMix SYBR No-ROX Kit (Bioline ، سيدني ، أستراليا). كانت بادئات التيلومير المستخدمة هي Telb1 (5′-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-3 ′) و Telb2 (5′-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTACCCTTACCCTTACCCT. الجين 18S الريبوسومي RNA (18S) (92 bp amplicon in أنوليس) باعتباره الجين المرجعي حيث تم التحقق من صحته مسبقًا في الزواحف (Plot، Criscuolo، Zahn، & Georges، 2012). كانت متواليات التمهيدي المستخدمة 18S-F (5′-GAGGTGAAATTCTTGGACCGG-3 ′) و 18S-R (5′-CGAACCTCCGACTTTCGTTCT-3). أظهرت منحنيات الذوبان الناتجة لكل من التيلومير و 18 S بعد التضخيم بواسطة qPCR ذروة واحدة ، مما يشير إلى تضخيم محدد لتسلسل الحمض النووي. تم إجراء qPCR بحجم نهائي قدره 20 ميكرولتر لكل من التيلوميرات و 18 S. تم استخدام DNA من 10 نانوغرام لكل تفاعل ، واستخدمت البادئات بتركيز 250 نانومتر. تمت إضافة SensiMix SYBR No-ROX Master Mix (بيولين ، أستراليا) بمقدار 11.25 ميكرولتر لكل تفاعل و MgCl2 يضاف لتركيز تفاعل 1.7 ملي مولار. تم إجراء ردود الفعل في ثلاث نسخ لكل عينة. تم إجراء عمليات التضخيم في جهاز تدوير حراري Rotor-Gene 6000 (Qiagen ، أستراليا) باستخدام خطوة تنشيط أولية Taq عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، وما مجموعه 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 60 درجة مئوية لمدة 15 ثانية. و 72 درجة مئوية لمدة 15 ثانية. تم إنشاء منحنى الذوبان بعد كل تشغيل على مدى درجة حرارة 60-95 درجة مئوية لضمان عدم تضخيم المنتج غير المحدد. تم تشغيل تفاعلات التحكم بدون قالب في ثلاث نسخ لكل مجموعة تمهيدي خلال كل تشغيل qPCR لضمان عدم وجود تلوث. تم إنشاء منحنيات قياسية ، باستخدام دم سحلية تم اختيارها عشوائيًا ، لكل من التيلوميرات و 18 S لضمان معدلات تضخيم ثابتة على نطاق واسع من تركيزات الحمض النووي. تم اعتبار رد الفعل متسقًا عند وجود خط مستقيم بامتداد ر 2 تتجاوز 985. يمكن أن تتناسب مع القيم التي تم الحصول عليها. تم إنشاء تخفيفات متسلسلة ثلاثية الأبعاد ، بدءًا من تركيز 26.67 نانوغرام / ميكرولتر وصولًا إلى 0.037 نانوغرام / ميكرولتر ، مع سبعة تركيزات مختلفة في المجموع (الشكل التكميلي S1) مما يعطي نطاقًا ديناميكيًا خطيًا من 0.037 إلى 26.67 نانوغرام / ميكرولتر. كانت كفاءة تضخيم التيلومير 1.05 وكانت كفاءة تضخيم 18S 0.96. تقع جميع العينات ضمن نطاق التركيز الناتج عن المنحنى القياسي. في جميع عمليات التشغيل ، كان لعناصر التحكم بدون قالب قيمة Cq على الأقل 10 مرات أعلى من أدنى عينة تم قياسها ، مما يشير إلى أن الحمض النووي الملوث يتكون بحد أقصى 0.001 ٪ تقريبًا من تركيز الحمض النووي الأصلي. تم استخدام LinRegPCR 2015.2 (Ruijter et al.، 2009 Tuomi، Voorbraak، Jones، & Ruijter، 2010) لتحليل بيانات qPCR. يحسب LinRegPCR تركيزات البداية الفردية على أساس متوسط ​​كفاءة amplicon ، ومضان الأساس ، وقيم دورة العتبة. تم استخدام تركيزات البداية من التيلومير (T) وجين التحكم (S 18S) لتحديد طول التيلومير النسبي باستخدام حساب T / S. تم تقييم التيلوميرات وجين التحكم في عمليات منفصلة. معاملات المقايسة المتوسطة للتغير لتشغيل qPCR للتيلومير (ن = 13) و 18 ثانية (ن = 13) كان التضخيم 16.73٪ و 38.21٪ ، على التوالي ، محسوبًا باستخدام عينة مرجعية عند 10 نانوغرام / ميكرولتر التي تم تضمينها في جميع الأشواط. نظرًا لارتفاع معامل الفحص الداخلي لعمليات تشغيل 18S ، قمنا بفحص القيم الفردية ووجدنا قيمة خارجية تضخم معامل الفحص الداخلي. عندما تمت إزالة هذا الخارج ، كان متوسط ​​معامل المقايسة 23.52٪. لاختبار ما إذا كانت هذه القيمة أكثر موثوقية ، قمنا بحساب معامل متوسط ​​جديد للمقايسة بناءً على معيار من المنحنى القياسي الذي تم تضمينه في جميع عمليات التشغيل بتركيز 8.89 نانوغرام / ميكرولتر. في ظل هذه الظروف ، كان متوسط ​​معامل المقايسة 22.30٪. هذا يشير إلى أن المتوسط ​​الفعلي لمعامل المقايسة لـ 18S كان حوالي 23 ٪. يعني (±SD) كانت معاملات التباين للتيلومير و 18 S 14.63 ± 0.1٪ و 12.52 ± 0.09٪ على التوالي. يعني (±SD) كانت كفاءات التضخيم الناتجة عن LinRegPCR عبر عمليات تشغيل التيلومير و 18 S qPCR 1.89 ± 0.04 و 1.98 ± 0.01 ، على التوالي. يمكن مقارنة قيم كفاءة LinRegPCR بالكفاءة التي تم الحصول عليها من خلال منحنى قياسي بطرح 1. من المحتمل أن يرجع الاختلاف في الكفاءة بين المنحنى القياسي وطريقة LinRegPCR إلى الإعداد اليدوي لـ Cq في طريقة المنحنى القياسية.

2.3 التحليل الإحصائي

لتحليل التأثيرات الخاصة بالتشكل على طول التيلومير ، تم إدخال بيانات qPCR أولاً في تحليل نموذج مختلط في Proc MIXED SAS 9.4 (معهد SAS) باستخدام طول التيلومير في فبراير (تاريخ انتهاء التجربة) كمتغير استجابة ، تم إصلاح المتنبئ تتشكل العوامل (أصفر ، برتقالي ، أحمر ، وأزرق) ، ومريلة (مضلعة وليست مضلعة) ، ومع الغرفة التي تم فيها وضع السحلية (مرقمة 1-3) كعامل عشوائي. عندما لا تكون "الغرفة" مهمة في اختبار نسبة الاحتمالية (2 & lt 1 ، ص & GT .9) ، أجرينا التحليل المقابل في Proc GLM (من أجل الحصول على ر 2 قيم لتحليلاتنا). تم استخدام طول التيلومير في ديسمبر كمتغير مشترك ، والذي يتحكم في طول التيلومير في بداية الفترة التجريبية. هذا يقيد أيضًا التحليل على التيلوميرات غير الخلالية ، لأنه يقيس بشكل فعال التغيير في طول التيلومير (على افتراض أن التيلوميرات الخلالية لا تتغير خلال الفترة التجريبية). ومع ذلك ، فإننا لا نقترح أن التيلوميرات الخلالية ليست ذات صلة بالصلاحية وتأثيرات اللياقة الأخرى قيد الاختيار بالاقتران مع ديناميكيات التيلومير. سيتم أرشفة البيانات التي تم الحصول عليها من هذه التجربة في درياد.


الدور المحتمل للتيلوميرات في العمر القصير لأسقلوب الخليج ، Argopecten irradians (Lamarck 1819).

تم تطوير العديد من نظريات الشيخوخة على مر السنين. رأى بيرل (1928 في Carlson & amp Riley 1998) علاقة عكسية بين طول العمر والتمثيل الغذائي ، مع النتائج الضارة لمعدل الأيض المفرط الذي يؤدي إلى زوال مبكر. تنص نظرية الجذور الحرة ، التي طرحها هارمان (1956) ، على أن المنتجات عالية التفاعل لعملية التمثيل الغذائي مثل أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) يمكن أن تلحق الضرر بالأنسجة. تفترض نظرية أخرى أن الهجمة المستمرة للإهانات البيئية (مثل الإشعاع الشمسي ، والتأثيرات السامة للمواد المبتلعة ، وما شابه ذلك) تتسبب في تلف الحمض النووي الذي يفوق قدرة الجسم على إصلاحه (Carlson & amp Riley 1998). يقترح رابع أن الجينات التي تنتج خصائص مواتية في الحياة المبكرة قد تصبح ضارة بعد التكاثر (Rose 1991). أدى التقدم الحديث في مجال البيولوجيا الجزيئية إلى طرق جديدة لدراسة الشيخوخة في حقيقيات النوى. التيلوميرات ، النوكليوتيدات المتكررة الموجودة في نهاية الكروموسومات ، ثبت أنها تعمل كساعة "انقسامية" قد تحدد مدى عمر الأنواع (بلاكبيرن 1991 ، هارلي 1991 ، رايت وأمبير شاي 2005). مع كل جولة من تكرار الخلية ، يتم فقد عدد من التيلوميرات (بلاكبيرن 1991 ، ليفي وآخرون 1992).

قد يحدث شيخوخة عندما يصل طول التيلومير إلى طول حرج ، مما يؤدي إلى حدوث تغييرات تشبه فواصل الحمض النووي وتوقف نقطة التفتيش اللاحقة (Zou et al.2002). على الرغم من عدم توضيح الصلة الدقيقة بين فقدان التيلومير وشيخوخة الخلية ، فمن المعروف أن بروتين التحكم في دورة الخلية ، p53 ، يقع بالقرب من التيلوميرات (ليفين وآخرون. 1993) ، وقد أظهرت دراسات أخرى وجود علاقة بين فقدان التيلومير و الشيخوخة (Kulju & amp Lehman 1995 ، Vaziri & amp Benchimol 1996 ، Whikehart et al.2000). كانت هناك بعض الدراسات التي تربط التيلوميرات الأطول ببقاء أطول. أظهرت التجارب أن إعادة تكوين الإنزيم تيلوميراز النشط في الخلايا ينتج عنه تيلوميرات مطولة وعمر طويل في زراعة الأنسجة البشرية (بودنار وآخرون ، 1998 ، Vaziri & amp Benchimol 1998). Joeng et al. (2004) ، أفرط في التعبير عن بروتين ربط التيلومير ، HRP-1 في الدودة ، Caenorhabditis elegans ، مما أدى إلى تيلوميرات أطول وعمر أطول لاحقًا. تبين أن ابتلاع الأشجار (Tachycineta bicolor) مع التيلوميرات الأطول تعيش لفترة أطول من تلك التي تحتوي على تيلوميرات أقصر (Haussmann et al.2005). على العكس من ذلك ، أدت التجارب التي منعت الإنزيم تيلوميراز من إضافة المزيد من التيلوميرات إلى نهايات الكروموسومات إلى تقصير التيلومير وموت الخلايا (هربرت وآخرون 1999).

لا توجد شيخوخة في العديد من اللافقاريات وبعض الفقاريات (على سبيل المثال ، تستمر هذه الحيوانات في النمو والتكاثر حتى تنتهي الظروف البيئية أو المرض أو الافتراس أخيرًا). كلابر وآخرون. (1998a) اكتشف إنزيم التيلوميراز في جميع أنسجة جراد البحر Homarus americanus. وبالمثل ، Koziol et al. (1998) وجد مستويات عالية من الإنزيم تيلوميراز في أنسجة الإسفنج المدروس. يعتبر تراوت قوس قزح ، Oncorhynchus mykiss "خالدًا" نظرًا لتوزيع تيلوميراز مماثل (Klapper et al. 1998b). عادة ، لا تظهر الأنواع ذات العمر الافتراضي المحدد نشاط التيلوميراز في خلاياها الجسدية ، ويحدد فقدان التيلومير اللاحق طول حياتها (Harley et al. 1992 ، Shay & amp Wright 2000). تتراوح أعمار بقاء بعض الرخويات ذات الصدفتين التجارية من أقل من عامين في جنس Argopecten ، (Belding 1910) إلى البطلينوس في أعماق المحيطات ، Artica Islandica ، التي يزيد عمرها عن 150 عامًا (Thompson et al. 1980 ، الحبال 1985). يبلغ متوسط ​​طول ذوات الصدفتين الأخرى في أعماق البحار ، Tindaria callistifomis ، 8.4 ملم بعد 100 عام وتنضج جنسيًا بعد 50 60 عامًا (Turekian et al. 1975). من غير المعروف حاليًا ما إذا كانت هذه الرخويات تحتوي على إنزيم تيلوميراز في جميع أنسجتها كما هو موضح في سرطان البحر ، أو لديها معدل دوران أقل بكثير للخلايا بسبب بيئتها في أعماق البحار إلى جانب تكملة كافية من التيلوميرات. أظهرت الأبحاث أن الرخويات النموذجية تظهر نفس التكرار التيلومري ، [(TTAGGG). sub.n] كما هو موجود في جميع الفقاريات التي تمت دراستها حتى الآن (Meyne et al. 1989). على سبيل المثال ، المحار. Crassostrea gigas ، (Guo & amp Allen 1997) ، اسكالوب الخليج ، Argopecten irradians irradians (Estabrooks 1999) ، المحار الوتد ، Donax trunculus ، (Plohl et al. 2002) ، والقواقع الأرضية ، Cantareus aspersus و C. mazzullii ، ( Vitturi et al.2005) ، يشتركون جميعًا في نفس التسلسل. ومع ذلك ، لم تكن هناك دراسات حتى الآن توضح وجود ارتباط بين العمر والشيخوخة وطول التيلومير في Mollusca. إب وآخرون. (1988) بحث عن الأسباب المحتملة للشيخوخة في أسقلوب الخليج ، A. irradians وافترض أنه قد يكون هناك صلة بين استقلاب البروتين ودورات إفراز الأعصاب مما يؤدي إلى اضطراب الغدد الصماء العصبية. توقع Barber and Blake (1986) أن التكلفة العالية للتكاثر قد تسرع من عملية الشيخوخة في السلالات الجنوبية ، A. irradianscentrieus. Bricelj et al. (1987 ب) خلص إلى أن الشيخوخة في اسكالوب الخليج في السنة الثانية لم تكن مرتبطة بتكاليف التمثيل الغذائي للجهد الإنجابي الثاني القادم.

قارنت الدراسة الحالية التيلوميرات لنوعين متقاربين من Argopecten. وهي A. purpuratus ، قادرة على البقاء على قيد الحياة 7 10 سنوات أو أكثر (DiSalvo et al. 1984 ، Alarcon & amp Wolff 1991) ، و A. irradians ، مع عمر أقل من 2 سنة. انقسم جنس Argopecten منذ حوالي 19 مليون سنة خلال العصر الميوسيني الأوسط (Waller 1969) ، في حين أن Argopecten purpuratus ، الموجود قبالة سواحل بيرو وتشيلي ، نشأ منذ حوالي 6 ملايين سنة وانفصل عن مخزون الأطلسي مع الإغلاق. من اتصال المحيط الأطلسي والمحيط الهادئ في نهاية العصر الميوسيني ، في حين انشق إشعاع أرجوبكتين منذ حوالي 1.5 مليون سنة خلال العصر البليستوسيني عندما أدى ارتفاع منسوب المياه إلى إنتاج الخلجان والأصوات الموجودة اليوم (Waller 1969). بعد التأكد أولاً من أن التسلسل التيلومري لـ A. purpuratus كان هو نفسه بالنسبة لـ A. irradians [(TTAGGG) .sub.n] تمت مقارنة أطوال التيلومير الخاصة بهم كتفسير محتمل للاختلاف في فترات حياتهم. بالإضافة إلى ذلك ، تمت مقارنة المتواليات شبه التيلوميرية لـ A. irradians مع تلك الخاصة بـ Placopecten magellanicus ، وهو نوع مع عدد مشروط من n = 19 ، نشأ منذ حوالي 65 مليون سنة. لقد ثبت أنه كلما كانت الأنواع أكثر حداثة ، كلما زاد عدد البقع الفرعية التي تمثل مواقع ذات معدلات عالية من إعادة التركيب بين الصبغيات ولها نتائج إيجابية وسلبية (روكو وآخرون 2001 ، ليناردوبولو وآخرون 2005).

تم تقديم حجة حول الفوائد المحتملة لإطالة العمر الافتراضي للأشعة Argopecten من خلال استطالة التيلومير كنهج إضافي لاستعادة السكان والحفاظ على كثافات التخزين الكافية في هذا النوع.

تم جمع ثلاثة إلى أربعة أسقلوب خليج تنتمي إلى كل مجموعة من A. irradians على فترات ستة أشهر تقريبًا من نفس الموقع في ميناء نانتوكيت ، ماساتشوستس. هذا يضمن أن جميع مقارنات أطوال التيلومير كانت من الأسقلوب لمدة عام تقريبًا. تم الحصول على عينات من Argopecten purpuratus من خلال كرم Karin Lohrmann Sheffield من Universidad Catolica del Norte في تشيلي و Louis DiSalvo من تشيلي. تم استخراج الحمض النووي من الغدة الهضمية والكلى والعضلات المقربة والقلب والخياشيم إما بالطريقة باستخدام DNAzol (Molecular Research، Inc.، Cincinnati، OH) ، انظر Estabrooks (1999). أو تعديل طفيف لطريقة سوكولوف (2000) التي تنتج كميات كبيرة من الحمض النووي الخالي من عديدات السكاريد المخاطية الموجودة غالبًا في الأنسجة الرخوية. في الطريقة الأخيرة ، تم تجانس كميات صغيرة من عينات الأنسجة ، 50-70 ميكروغرام في أنابيب سعة 1.5 مل لفترة وجيزة في 1.0 مل من كاشف lysing (50 ملي مولار Tris-HCl ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 10 ملي مول EDTA ، 1٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، 0.2-0.4 مجم / مل بروتيناز K) وحضنت لمدة ساعتين عند 55 درجة مئوية. تمت إضافة 100 [ميكرو] لتر من KCl المشبع ، وخلطها ووضع الأنابيب على الجليد لمدة 5 دقائق. بعد الدوران عند 14000 جم ، تم نقل المادة الفائقة إلى أنابيب جديدة واستخلاصها مرتين بحجم متساوٍ من الفينول: كلوروفورم: كحول أيزو أميلي (25: 24: 1) باستخدام نظام Eppendorpf Phase-Lok (Westbury ، NY). تم بعد ذلك نقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وتم ترسيب الحمض النووي بكمية متساوية من الإيثانول بنسبة 100٪ ، وغسلها مرتين في 70٪ من الإيثانول ، ثم تم تصريفها وإعادة تكوينها باستخدام محلول TE عازل ، درجة الحموضة 8.0. تمت إضافة RNase A عند 0.2 مجم / مل ثم تم تحديد كمية الحمض النووي عند 260/280 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي Beckman DU7. تم قطع الكميات المعروفة من الحمض النووي باستخدام إنزيمات التقييد RsaI (Sigma-Aldrich ، St.Louis، MO) و HinfI (Amersham Biosciences، Piscataway، NJ) وفقًا لتوصيات المصنّعين وتم عزلهم بالكهرباء على جل agarose 0.8٪ لمدة ساعة تقريبًا عند 105V. يتكون كل مسار كهربائي من الحمض النووي من العام الأول والعام الثاني من الإسكالوب الخليجية المأخوذة في أوقات مختلفة من ميناء نانتوكيت. كان الإسكالوب في كل فئة عمرية من نفس المنطقة من المرفأ وبالتالي من نفس المجموعة ، مما يساعد على ضمان اختلاف 12 شهرًا في العمر في كل وقت أخذ العينات. تم بعد ذلك نقل الحمض النووي إلى أغشية النايلون عن طريق النشاف الجنوبي في 0.4M هيدروكسيد الصوديوم ، وشطفه لفترة وجيزة في 2x SSC وتجفيفه بالهواء بين صفائح من ورق الترشيح 3 مم. تم بعد ذلك تحميص الغشاء عند 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتثبيت الحمض النووي في الغشاء. تم الكشف عن التيلوميرات باستخدام إجراء الإشعاع الكيميائي الموصوف في Estabrooks (1999). تم تقدير متوسط ​​أطوال التيلومير باستخدام علامات الوزن الجزيئي (kb) المضمنة في كل شوط.

يتم التعبير عن التيلوميرات على أنها شظايا تقييد التيلومير (TRF) لأنها تقطع من نهايات الكروموسوم بواسطة إنزيمات التقييد عند نقطة أسفل الجزء الداخلي من التيلومير (TTAGGG) وقد تحتوي على كمية صغيرة من الحمض النووي غير التيلومري.

يتبع الشكل 1 الانخفاض في أطوال التيلومير في الغدة الهضمية في Argopecten irradians بالمقارنة مع A. purpuratus. سنة 1 A. irradians من 0 إلى 12 شهرًا وفي هذه المرحلة تكون ناضجة جنسياً وجاهزة للتكاثر. حددت القياسات شبه الكمومية أن متوسط ​​أطوال التيلومير لـ A. purpuratus (2 سنة) يبلغ حوالي 9.4 كيلو بايت. أسفر تشغيل تيلومير تمثيلي لـ A. irradians عند عمر 6 أشهر تقريبًا عن طول 2.3 كيلو بايت و 0.75 كيلو بايت لـ A. irradians عند 18 شهرًا. تم جمع عينات من مجموعات السنة الأولى والسنة الثانية من A. irradians معًا من ميناء نانتوكيت. يضمن هذا أن جميع مقارنات أطوال التيلومير كانت من الأسقلوب بفارق سنة واحدة تقريبًا وأظهرت جميعها انخفاضًا كبيرًا في أطوال التيلومير بين المجموعتين. لم يحدث في أي وقت من الأوقات أن يحتوي الإسكالوب في العام الثاني على تيلوميرات أطول من تلك الموجودة في أي عام 1 ، وأظهرت أنسجة الغدة الهضمية فقط الاختلافات الدراماتيكية في الطول ، على الأرجح بسبب ارتفاع معدل دوران الخلايا.

أسقلوب العام الثاني يبدأ من 13 إلى 24 شهرًا ، ولكنه عمومًا لن يعيش لإكمال السنة الثانية. يتم عرض TRFs من أسقلوب الخليج الذي يدخل عامه الثالث (24 شهرًا وأكثر) في الشكل 2 ، ويقارن أنسجة القلب مع تلك الموجودة في الغدة الهضمية. لا تنقسم عضلة القلب ، وبالتالي تظهر مجموعة موحدة من التيلوميرات الطويلة (عالية MW) التي لا تقصر مع تقدم العمر ، بينما تحتوي الغدة الهضمية على عدد قليل جدًا من التيلوميرات من أي طول. كما أن مستوى التيلوميرات في العضلات المقربة لمجموعتين من A. irradians يظل هو نفسه كما هو متوقع ، حيث أن الأنسجة العضلية لا تتكاثر بشكل عام (الشكل 3).

يقارن الشكل 4 تيلوميرات الغدة الهضمية لأسقلوب أعماق البحار طويل العمر ، Placopecten magellanicus (4 سنوات) مع تلك الموجودة في أسقلوب الخليج الأول. لاحظ ندرة التسلسلات شبه التيلوميرية في P. magellanicus ، مما يدعم النظرية القائلة بأنه كلما كانت الأنواع أكثر حداثة ، يمكن العثور على مزيد من التسلسلات الفرعية (Meyne et al. 1990 ، Rocco et al. 2001).

عدد الكروموسوم للأنواع الموجودة من الأسقلوب له عدد أحادي الصيغة الصبغية ، ن = 19 ، في حين أن أسقلوب الخليج ، أ. قد يكون هذا الانخفاض في عدد الكروموسوم بسبب اندماج روبرتسون ، حيث اندمجت الكروموسومات عن بعد ، مما يقلل من إجمالي عدد الكروموسوم (Wang & amp Guo 2004). لاحظوا أيضًا أن A. irradians تكبدت خسائر في ذراع الكروموسوم بما يقرب من 50 ٪ مقارنة مع الرقم المشروط 2 n = 38 ، واقترحوا أن ذراعي الصدفتين الأسلاف ربما أصبح رباعي الصبغيات في وقت ما كتفسير لكيفية قدرة Argopecten على تحمل مثل هذه الخسائر الكبيرة في الكروموسوم ولا تزال على قيد الحياة.

معظم أنواع الإسكالوب التي تمت دراستها حتى الآن لها عدد كروموسوم مشروط n = 19 ، وتعيش أطول من أسقلوب الخليج (Beaumont & amp Zouros 1991). يُقترح أن مادة الحمض النووي الرئيسية المشاركة في طول العمر ربما تكون قد ضاعت في بعض أنواع الإسكالوب على طول الطريق ، مما يترك لدى A. irradians ما يكفي فقط للبقاء على قيد الحياة جهد تكاثر واحد.

كدليل إضافي ، Rocco et al. (2001) أظهر عددًا متزايدًا من التسلسلات الفرعية من TTAGGG في العديد من أنواع Chondrichthian في مراحل مختلفة من التطور والتي أدت إلى اختزال الكروموسوم. قد يكون هذا هو الحال مع أسقلوب الخليج. كلما كانت الأنواع أكثر حداثة ، شوهدت تسلسلات تيلوميرية داخلية أكثر (Meyne et al. 1990). ومن المثير للاهتمام ، أنه لم يتم العثور على تسلسل TTAGGG الخلالي في المحار ، Crassostrea gigas (ن = 10) ، ذو الصدفتين الأكثر بدائية (Guo and Allen 1997) ، أو في C. angulata (Cross et al. 2005) ، بينما الدراسة الحالية (الشكل 1). .4) كانت قادرة على إثبات وجودها في الأراديانات الأحدث (1.5 مليون سنة) وفقط بشكل طفيف في أسقلوب أعماق البحار ، P. magellanicus (65 مليون سنة). زو وآخرون. (2002) وجدت في نوع من الغزلان ، تسلسل التيلومير الداخلي (subtelomeric) هي أيضًا مواقع هشاشة قد تكون بقايا من اندماج روبرتسون الذي قد يساهم في الواقع في زيادة عدم استقرار الكروموسوم. في البشر ، تم إنشاء ما يقرب من 50 ٪ من جميع التسلسلات دون التيلوميرية بعد اختلاف الشمبانزي / الإنسان (Linardopoulou et al.2005).

غالبًا ما يطلق على A. irradians اسم semelparous (Barber & amp Blake 1986 ، Bricelj et al. 1987a ، Estabrooks 1999 ، Tettelbach et al. 1999 من بين أمور أخرى) ، ولكن لا يبدو أن هناك ميزة انتقائية لأسقلوب الخليج الذي يمتلك مثل هذا العمر القصير. عادة ما يتم العثور على الوجود شبه المثالي عندما تكون هناك حاجة إلى وضع كل طاقته في جهد إنجابي واحد مع الموت الناتج بعد ذلك بوقت قصير. يظهر هذا ، على سبيل المثال ، في سلمون المحيط الهادئ ، Oncorhynchus spp. ، حيث يتم جلب كل الطاقة اللازمة لعملية التكاثر من المحيط في شكل مغذيات مخزنة لاستخدامها في أعلى مجرى النهر (Morbey et al. 2005) . على العكس من ذلك ، يدخل أسقلوب الخليج في عامه الثاني بعد التزاوج عن طريق مضاعفة وزنه من سبتمبر إلى نهاية نوفمبر (Bricelj et al. 1987b ، Tettelbach et al.2.2002). يتم تخزين الدهون والكربوهيدرات والبروتينات لفصل الشتاء ، وقد يعيش الكثير منها على الأقل لبدء تكوين الأمشاج في أوائل الربيع ، على الرغم من ندرة البقاء على قيد الحياة لإكمال التبويض الثاني (Belding 1910). وجد Bricelj & amp Krause (1992) معدلًا مرتفعًا للبقاء على قيد الحياة لموسم التكاثر الثاني دون اكتمال (90 ٪ منهم على قيد الحياة حتى مارس). يبدو أن A. irradians قد فوجئت ، إذا جاز التعبير ، فقد تراجعت بسبب عمليات الحذف التيلوميرية ، وربما أفضل وصفًا لها بأنها حالة "مقاطعة متكررة".

قد تستنتج النظرية الداروينية أن سمة تاريخ الحياة الفردية هذه (التكاثر) قد تم تحسينها بمرور الوقت ، ولكن وجهة نظر أكثر واقعية قد تشير إلى أن القيود الفسيولوجية للعيش في ظل فرص خاصة بالأنواع قد تسفر عن استراتيجية ، رغم أنها ليست مثالية ، " جيد بما فيه الكفاية "(دارلينجتون 1977 ، تومي وآخرون 1983). من المفترض أن جزءًا على الأقل من مادة الكروموسومات الرئيسية المفقودة بمرور الوقت كانت تيلوميرات. يبدو أن الغدة الهضمية المنتجة للطاقة بخلاياها سريعة الانقسام هي العضو الرئيسي الذي يفقد التيلوميرات الكافية لبدء الشيخوخة والموت اللاحق لأسقلوب الخليج. عند مقارنة التيلوميرات في الغدة الهضمية لحيوان Argopecten purpuratus يبلغ من العمر عامين مع تلك الخاصة بأشعة Argopecten للسنة الأولى والثانية ، يمكن ملاحظة أن لدى A. purpuratus تيلوميرات أطول (الشكل 1). تشير التقديرات شبه الكمية إلى أن أ. بوربوراتوس البالغ من العمر عامين يحتوي على شظايا تقييد التيلومير (TRF) بأطوال أطول بكثير من تلك الخاصة بالسنة الأولى من A. irradians. يوضح الشكل 3 تيلوميرات أقصر في الغدة الهضمية من A. irradians تدخل عامها الثالث. لا تقصر تيلوميرات القلب والعضلة المقربة لأن هذه الأنسجة لا تخضع عمومًا لانقسام الخلايا (الشكل 3،4).

يوضح الخيشوم والكلى أيضًا خسائر التيلومير كما هو متوقع ، ولكن ليس بالقدر الذي يظهر في الغدة الهضمية (البيانات غير معروضة). يمكن تفسير ذلك في الكلى ، حيث يخزن هذا العضو العديد من حبيبات الإخراج التي يتم وضعها طبقة تلو الأخرى على مدى فترة طويلة ليتم طردها أخيرًا في المسالك البولية (جورج وآخرون ، 1980 ، مورس 1987). ستؤدي هذه العملية إلى تباطؤ معدل دوران الخلايا وتقليل التيلوميرات المفقودة.

في حين أن الوقت النهائي للوفاة قد يكون ناتجًا عن الاختلافات في البيئة إلى جانب حالة الأسقلوب الفردية كما اقترح Bricelj et al. (1987 ب) ، من المرجح أن يكون فقدان التيلومير هو التعديل الخشن للساعة الانقسامية التي تحدد متوسط ​​عمر هذا النوع. يمكن تعديل الضبط الدقيق بعدة عوامل مثل العدد الأولي للتيلوميرات ، والمعدل الفردي لدوران الخلية. قد يكون للإسكالوب في المياه الأعمق والأبرد معدل استقلاب أبطأ ، في حين أن تلك التي تفرخ في وقت لاحق من الموسم ستواجه ظروفًا مختلفة في مراحل مختلفة من حياتها. أولئك الذين يخزنون عددًا أقل من العناصر الغذائية لفصل الشتاء الثاني القادم قد يكونون في حالة أضعف ، كما هو الحال بالنسبة للمصابين بالطفيليات.

يمكن أن يفسر هذا أيضًا الملاحظات التي تشير إلى أن الشيخوخة في الأسقلوب قد تكون مرتبطة بالحجم وكذلك مرتبطة بالعمر (Gutsell 1930، Orensantz 1986، Bricelj et al. 1987b) مع الأسقلوب الأصغر التي تعيش لفترة أطول لوجود عدد أقل من التكرارات الخلوية وبالتالي فقد أقل من التيلوميرات.

يمكن أن تحدث نفوق أسقلوب الغار على مدى فترة تصل إلى عدة أشهر ، تبدأ عادةً في أوائل الشتاء وتستمر حتى الربيع في الشمال الشرقي (Belding 1910، Bricelj et al. 1987b). يُعتقد أن النظريات الأخرى للشيخوخة ، بما في ذلك تراكم الأخطاء الجينية بمرور الوقت ، والأضرار التي تسببها الجذور الحرة أو معدل الأيض المفرط قد يكون لها تأثيرها على تحديد تاريخ وفاة الأسقلوب الفردي ، ولكن ليس على العمر الإجمالي. من الأنواع.

يُقترح أن A. irradians لديها القدرة على حياة أطول ، وفقط الخسارة المؤسفة لمواد الكروموسومات الرئيسية من بقايا رباعية الصبغ الأصلي تمنعها من القيام بذلك. قد تكون نتيجة التطور إلى نوع تكيف مع الخلجان الضحلة فقدان التسلسلات التيلوميرية الرئيسية. يبدو أنه يقوم بجميع الاستعدادات اللازمة للبقاء على قيد الحياة خلال الشتاء القادم وما بعده ، ولكنه نادرًا ما يعيش لإكمال موسم التكاثر الثاني. يمكن أن يمنح التلاعب الوراثي لزيادة عدد التيلوميرات في A.

وهذا يقودنا إلى السؤال التالي: إذا كان طول العمر هو الحل لبعض المشاكل التي تواجه A. irradians ، فما مدى نجاح A. purpuratus في تشيلي؟ تواجه الصناعة هناك مجموعة مختلفة من المشاكل في الحفاظ على مستوى عتبة ناجح من الإسكالوب في البرية ، وخاصة الاستخراج غير القانوني. تعتبر الأتراب على مدار العام بذرة ويؤخذها الغواصون دون تمييز (Stotz & amp Gonzalez 1997) ، مما يجعل تربية الأحياء المائية مسؤولة عن غالبية إنتاج الإسكالوب اليوم في شيلي (von Brand et al. 2006). قد يكون للتهجينات الوراثية للفطر A. irradians irradians و A. purpuratus إمكانية إطالة عمر الأول. كلاهما من أنواع المياه الباردة مع n = 16 وأنماط متطابقة ، 5st (subtelocentric) و 11t (عن بُعد) (Gajardo et al. 2002 ، Wang & amp Guo 2004). يقول Waller (1969) أن A. purpuratus ، التي يزيد عمرها عن A. irradians بـ 4.5-5 مليون سنة ، لم تشهد تغيرًا طفيفًا بمرور الوقت. بالإضافة إلى ذلك ، Chen et al. (1991) وجد 90٪ من التهجينات بين Chlamys farreri (n = 19) و A. irradians (n ​​= 16) ، نجت حتى 12 يومًا. يبدو من المعقول أن نتوقع أن يكون التهجين بين A. irradians و A. purpuratus أفضل حالًا. أدى حدث النينو عام 1983 ، عندما ارتفعت درجات حرارة المياه المحيطة بشكل كبير ، إلى زيادة عدد الأسقلوب الطبيعي بمقدار ستين ضعفًا. اقترح Wolff (1987) أن A. purpuratus ، وهي نوع طبيعي من أنواع المياه الباردة ، ربما احتفظت بالعديد من خصائص المياه الدافئة من الميوسين المداري / شبه الاستوائي. إذا كان هذا صحيحًا ، فإن التهجين بين A. purpuratus و A. حاليًا ، يجري البحث لتحديد قابلية التهجين بين A. irradians irradians و A. purpuratus وقياس التيلوميرات الناتجة ، إذا نجحت هذه التهجينات.

تتقدم الكاتبة بالشكر للدكتورة سارة أوكتاي من المحطة الميدانية بجامعة ماساتشوستس وفاليري هول لمساهمتهما الحاسمة. تم دعم هذا البحث بمنح من إدارة الموارد البحرية والساحلية في نانتوكيت ومؤسسة PADI.

ألاركون ، إ. و م. وولف. 1991. Estudio biologico pesquero sobre el recurso de ostiones (Argopecten purpuratus) de bahia Tongoy durante el fenomeno El Nino 1982-83. استثمار. بيسك. 32: 167-173.

باربر ، بي جيه وأمبير إن جيه بليك. 1986. جهد الإنجاب والتكلفة في أسقلوب الخليج ، Argopecten irradianscentricus. دولي J. من المقلوب. ريبرود. وتطوير. 10: 51-57.

بومونت ، إيه آر وأمبير إي زوروس. 1991. علم الوراثة من الأسقلوب. في: S.E. Shumway ، محرر. الإسكالوب: علم الأحياء والبيئة وتربية الأحياء المائية. التطورات في تربية الأحياء المائية وعلوم المصايد. المجلد. 21. أمستردام: إلسفير. ص 585-623.

بيلدينغ ، د. ل. 1910. تقرير عن مصايد الاسكالوب في ماساتشوستس. كومنولث ماساتشوستس. بوسطن. 150 ص.

بلاكبيرن ، هـ. 1991. هيكل ووظيفة التيلوميرات. طبيعة 350: 569-573.

بودنار ، A.G. ، M. Ouellette ، M. Frolkis ، S. E. Holt ، C.-P. تشيو ، جي بي مورين ، سي بي هارلي ، جي ، دبليو شاي ، إس ليشتشتاينر وأمبير دبليو إي رايت. 1998. إطالة العمر الافتراضي بإدخال الإنزيم تيلوميراز في الخلايا البشرية الطبيعية. Science 279: 349-352.

Bricelj، V. M.، J. Epp & amp R. E. Malouf. 1987 أ. علم وظائف الأعضاء المقارن للصغار والكبار من أسقلوب الخليج Argopecten irradians (Lamarck): معدل الوفيات والنمو واستهلاك الأكسجين. J. إكسب. مارس بيول. ايكول. 112: 73-91.

Bricelj، V. M.، J. Epp & amp R. E. Malouf. 1987 ب. تباين غير محدد في دورات النمو التناسلي والجسدي لأسقلوب الخليج. Argopecten irradians. مارس Ecol. بروغ. سر. 36: 123-137.

Bricelj ، V.M & amp M. K. Krause. 1992. تخصيص الموارد وعلم الوراثة السكانية لأسقلوب الخليج و Argopecten irradians: آثار العمر وتغاير الزيجوت اللوزيمي على الإنتاج الإنجابي. مارس بيول. 113: 253-261.

كارلسون ، جي سي وأمبير جي سي إم رايلي. 1998. دراسة لبعض نظريات الشيخوخة البارزة. إكسب. جيرونتول. (1/2): 127-134.

Chen ، Q. ، J. Xiang ، Y. Qin ، B. Kou & amp H. Wang. 1991. المرجع. في: Wang، Y. & amp X. Guo. 2004. إعادة ترتيب الكروموسومات في Pectinidae التي كشفت عنها مواقع الرنا الريباسي وآثارها على تطور ذوات الصدفتين. بيول. ثور. 207: 247-256.

كروس ، إي ، إي دياز. I. Sanchez & amp L. Rebordinos. 2005. التوصيف الجزيئي والخلوي للكروموسومات Crassostrea angulata. تربية الأحياء المائية 247: 135-144.

دارلينجتون ، بي جيه ، الابن 1977. تكلفة التطور وعدم دقة التكيف. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 74: 1647-1651.

ديسالفو ، إل إتش ، إي ألاركون ، إي مارتينيز وأمبير إي أوريبي. 1984. التقدم في الثقافة الجماهيرية لكلاميس (أرغوبكتين) بوربوراتوس لامارك (1819) مع ملاحظات عن تاريخها الطبيعي. القس شيل. اصمت. نات. 57: 34-45.

إيب ، ج. ، ف. م. بريسلج ، وأمبير ر. إي. معلوف. 1988. التقسيم الموسمي واستخدام احتياطيات الطاقة في فئتين عمريتين من أسقلوب الخليج Argopecten irradians (Lamarck). J. إكسب. مارس بيول. ايكول. 121: 113-136.

Estabrooks، S. L. 1999. تيلوميرات أسقلوب الخليج ، Argopecten irradians (Lamarck). J. المحار الدقة. 18: 401-404.

جاجاردو ، جي ، إم باراجيز وأمبير إن كوليهويك. 2002. تحليل النمط النووي ونطاقات الكروموسوم للأسقلوب التشيلي والبيروفي ، Argopecten purpuratus (لامارك ، 1819). J. المحار الدقة. 21: 585-590.

جورج ، إس جي ، بي جي إس بيري وأمبير تي إل كومبس. 1980. العزل والتحليل الأولي للحبيبات الغنية بالمعادن من كلية الأسقلوب ، Pecten maximus (L.). J. إكسب. مارس بيول. ايكول. 42: 143-156.

Guo، X. & amp S. K. Allen، Jr. 1997. التألق في الموقع تهجين من تسلسل التيلومير الفقاري إلى نهايات الكروموسوم لمحار المحيط الهادئ ، Crassostrea gigas Thunberg. J. المحار الدقة. 16: 87-89.

Gutsell، J. S. 1930. التاريخ الطبيعي لأسقلوب الخليج. ثور. الولايات المتحدة بور. سمكة. 45: 569-632. Harley، CB 1991. فقدان التيلومير: ساعة انقسامية أم قنبلة زمنية وراثية؟ مراد. الدقة. 256: 271-282.

Harley، C. B. 1991. خسارة التيلومير: ساعة انقسامية أم قنبلة زمنية وراثية؟ موتات. الدقة. 256: 271-282.

Harley، C.B، H. Vaziri، C.M Counter & amp R. C. Allsopp. 1992. فرضية التيلومير للشيخوخة الخلوية. إكسب. جيرونتول. 27: 375-382.

Harman، D. 1956. Aging-A نظرية تقوم على كيمياء الجذور الحرة والإشعاع. جي جيرونتول. 12: 298-300.

هوسمان ، إم إف ، دي دبليو وينكلر وأمبير سي إم فيك. 2005. التيلوميرات الأطول المرتبطة ببقاء أعلى في الطيور. بيول. بادئة رسالة. 1: 212-214.

هربرت ، بي إس ، إيه إي بيتس ، إس آي بيكر ، إس إي هاميلتون ، دبليو إي رايت ، جي دبليو شاي وأمبير دي آر كوري. 1999. تثبيط التيلوميراز البشري في السقوف البشرية الخالدة يؤدي إلى تقصير تدريجي للتيلومير وموت الخلايا. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 96: 14276-14281.

Joeng ، K. S. ، E.J Song ، K.-J. لي و أمبير ج. لي. 2004. عمر طويل في الديدان ذات الحمض النووي التيلومري الطويل. نات. جينيه. 36: 607-611.

كلابر ، دبليو ، ك.هايدورن ، ك. كون ، ر.باروارش وأمبير جي كروب. 1998 أ. نشاط التيلوميراز في الأسماك "الخالدة". FEBS ليت. 434: 409-412.

Klapper ، W. ، K. Kuhne ، K. K. Singh ، K. Heidorn ، R. Parwaresch & amp G. Krupp. 1998 ب. يرتبط طول عمر الكركند بتعبير التيلوميراز في كل مكان. FEBS ليت. 439: 143-146.

كوزيول ، سي ، آر بوروجيفيتش ، آر. ستيفن وأمبير دبليو إي جي مولر. 1998. أنظمة نموذج الإسفنج (بوريفيرا) لدراسة التحول من الخلايا الجسدية الخالدة إلى الخلايا الجسدية الشائخة: نشاط التيلوميراز في الخلايا الجسدية. ميكانيكي. سن. ديف. 100: 107-120.

كولجو. K. S. & amp J. M. Lehman. 1995. زيادة البروتين p53 المرتبط بالشيخوخة في الخلايا الليفية ثنائية الصبغيات البشرية. إكسب. دقة الخلية. 217: 336-345.

ليفين ، إيه جيه ، إيه تشانغ وأمبير ديتمير. 1993. الجين p53 الكابت للورم. مختبر J. كلين. ميد. 123: 817-823.

ليفي ، إم زد ، آر سي ألسوب ، أ.ب.فوتشر. سي دبليو جريدر وأمبير سي بي هارلي. 1992. مشكلة تكرار نهاية التيلومير وشيخوخة الخلية. جيه مول. بيول. 225: 951-960.

ليناردوبولو ، إي في ، إي إم ويليامز ، واي فان ، سي فريدمان ، جي إم يونغ وأمبير بي جي تراسك. 2005. التيلوميرات الفرعية البشرية هي نقاط ساخنة لإعادة التركيب بين الكروموسومات والازدواجية القطاعية. Nature 437: 94-100.

مين ، جيه ، آر جيه بيكر ، إتش إتش هوبارت ، تي سي هسو ، أو إيه رايدر ، أو جي وارد ، جيه إي وايلي ، دي إتش ورستر هيل تي إل ييتس وأمبير آر كيه مويزيس. 1990. توزيع المواقع غير التيلوميرية للتسلسل التيلومري [(TTAGGG) .sub.n] في كروموسومات الفقاريات.الكروموسوما 99: 3-10.

مين ، آر كيه ، آر إل راتليف وأمبير آر كيه مويزيس. 1989. حفظ تسلسل التيلومير البشري (TTAGGG) ن بين الفقاريات. بروك. ناتل. أكاد. علوم. USA 86: 7049-7053.

موربي ، واي إي ، سي إي براسيل وأمبير إيه بي هندري. 2005. الشيخوخة السريعة في سلمون المحيط الهادئ. عامر. عالم الطبيعة 166: 556-568.

مورس ، M. P. 1987. التشكل الوظيفي المقارن لنظام الإخراج ذو الصدفتين. أكون. زول. 27: 737-746.

Orensantz، J. M. 1986. الحجم والبيئة والكثافة: تنظيم مخزون التقوقع وآثاره الإدارية. علبة. المواصفات سنة النشر. سمكة. أكوات. علوم. 92: 195-227.

بلول ، إم ، إي براتس ، إيه مارتينيز لاجي ، إيه جونزاليس-تيزون ، جيه مينديز وأمبير إل.كورنوديلا. 2002. توطين التيلومير للجينوم السداسي من النوع الفقاري ، [(TTAGGG) .sub.n] ، في المحار الإسفيني دوناكس trunculus وجينومات اللافقاريات البحرية الأخرى. J. بيول. تشيم. 277: 19839-19846.

روكو ، L. ، D. Costagliola & amp V. Stingo. 2001. [(TTAGGG) .sub.n] تسلسل تيلومري في كروموسومات سلاشيان. الوراثة 87: 583-588.

الحبال ، J.W. 1985. الأساليب الحديثة المستخدمة في تحديد عمر ذوات الصدفتين المحيطية. نوتيلوس 99: 53-57.

روز ، م. ر. 1991. علم الأحياء التطوري للشيخوخة. نيويورك: مطبعة جامعة أكسفورد.

شاي وجيه دبليو وأمبير دبليو إي رايت. 2000. هايفليك. حده ، والشيخوخة الخلوية. نات. القس مول. خلية بيول. 1: 72-76.

سوكولوف ، إي ب. 2000. طريقة محسنة لعزل الحمض النووي من أنسجة موللسكان الغنية بعديد السكاريد المخاطي. J. مول. عشيق. 66: 573-575.

ستوتز ، دبليو بي وأمبير إس إيه جونزاليس. 1997. وفرة ونمو وإنتاج الإسكالوب البحري Argopecten purpuratus (Lamarck 1819): أسس الاستغلال المستدام لأسطح المحار الطبيعي في شمال وسط شيلي. سمكة. الدقة. 32: 173-183.

Tettelbach ، S. T. ، C.F Smith ، R. Smolowitz ، K. Tetrault & amp S. Dumais. 1999. دليل على تساقط التبويض في أسقلوب الخليج الشمالي Argopecten irradians (Lamarck 1819) في نيويورك. J. المحار الدقة. 18: 47-58.

تيتيلباخ ، إس ك ، سي إف سميث ، بي وينكزيل وأمبير إي ديكورت. 2002. تكاثر اسكالوب الخليج البرية المزروعة والمزروعة في المفرخات ، Argopecten irradians ، نسبة إلى التجمعات الطبيعية. تربية الأحياء المائية. إنترنات. 10: 279-296.

طومسون ، آي ، دي إس جونز وأمبير دريبيلبيس. 1980. نطاقات النمو الداخلي السنوي وتاريخ حياة المحيط quahog Artica islandica (Mollusca: Bivalvia). مارس بيول. 57: 25-34.

تومي ، ج ، ت. هاكالا وأمبير إي هوكيوجا. 1983. مفاهيم بديلة للجهد الإنجابي وتكاليف التكاثر والاختيار في تطور تاريخ الحياة. أكون. زول. 23: 25-34.

Turekian، K. K.، J. K. Cochran، D. P. Kharkar، R.M Cerrato، J.R Vaisnys، H.L Sanders، J.F Grassle & amp J. A. Allen. 1975. معدل النمو البطيء للبطلينوس في أعماق البحار يحدده [sup.228] Ra التسلسل الزمني. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 72: 2829-2832.

Vaziri، H. & amp S. Benchimol. 1996. من فقدان التيلومير إلى استقراء p53 وتنشيط مسار تلف الحمض النووي عند الشيخوخة: نموذج فقدان التيلومير / تلف الحمض النووي لشيخوخة الخلية. إكسب. جيرونتول. 31: 295-301.

Vaziri، H. & amp S. Benchimol. 1998. إعادة تكوين نشاط التيلوميراز في الخلايا البشرية الطبيعية يؤدي إلى استطالة التيلوميرات وإطالة العمر التكراري. بالعملة. بيول. ٨: ٢٧٩-٢٨٢.

Vitturi، R.، A. Libertini، L. Sineo، I. Sparacio، A. Lannino، A. Gregorini & amp M. Colomba. 2005. الوراثة الخلوية للقواقع الأرضية Cantareus aspersus و C. mazzullii (Mollusca: Gastropoda: Pulmonata). ميرون 36: 351-357.

فون براند ، إي ، جي إي ميرينو ، إيه أباركا وأمبير دبليو ستولز. 2006. الإسكالوب: علم الأحياء والبيئة وتربية الأحياء المائية. في: S.E. Shumway & amp G.J. بارسونز ، المحررين. أمستردام: Elsevier B.V 1293-1314.

Wada، K. 1978. الأنماط الكروموسومية لثلاثة ذوات الصدفتين: المحار ، Isognomon alatus و Pinctada imbricata ، و bay scallop ، Argopecten irradians. بيول. ثور. 155: 235-245.

Waller ، T. R. 1969. تطور مخزون Argopecten gibbus (Mollusca: Bivalvia) ، مع التركيز على الأنواع الثلاثية والرباعية في شرق أمريكا الشمالية. J. Paleon. 4 ، الجزء الثاني من الثاني ، الملحق رقم 5.

وانغ ، واي. وأمبير إكس. جو. 2004. إعادة ترتيب الكروموسومات في Pectinidae التي كشفت عنها مواقع الرنا الريباسي وآثارها على تطور ذوات الصدفتين. بيول. ثور. 207: 247-256.

Whikehart ، D. R. ، S. J. Register ، Q. Chang & amp B. Montgomery. 2000. علاقة التيلوميرات و p53 في مزارع الخلايا البطانية للقرنية البقريّة الشائخة. استثمار. العيون. الخيال المرئي. 41: 1070-1075.

وولف ، م. 1987. الديناميات السكانية لأسقلوب بيرو Argopecten purpuratus خلال ظاهرة النينو عام 1983. Can. J. فيش. أكوات. علوم. 44: 1684-1691.

رايت ، دبليو إي و جي دبليو شاي. 2005. بيولوجيا التيلومير في الشيخوخة والسرطان. جيه. جير. شركة 53: S292-S294.

Zou ، Y. ، X. Yi ، W.E Wright & amp J. W. Shay. 2002. يمكن للتيلوميراز البشري أن يخلد خلايا Muntjac الهندية. إكسب. دقة الخلية. 281: 63-76.

STEPHEN L. ESTABROOKS * مختبر نانتوكيت البحري ، 0 شارع إيستون ، نانتوكيت ، ماساتشوستس 02554


شكر وتقدير

نشكر جوانا بورليد للمساعدة في العمل الجزيئي ، وبنجامين جوه ، وكريستا وودوارد ، وجورديا ريجتر على الاحتفاظ بمخزون الأسماك وأخذ العينات ، وبريت ويسمور لمشاركة متواليات بيتا أكتين التمهيدي ، والمحرر واثنين من المراجعين المجهولين للتعليقات البناءة. تم دعم الدراسة بواسطة Formas (21.5 / 2002-1037 و 215-2009-463 ، DB 2008-383 ، JIJ) ، بتمويل من Oscar och Lili Lamms Minne (FO2009-0007 و FO2012-0039 ، AP) ، كارل تريجرز ستيفتلس ( CTS 09: 294، AP) ، وكذلك بواسطة النظام التنظيمي الكندي للتكنولوجيا الحيوية (RHD).


نتائج

تحديد العمر من خلال حساب GLG

تراوحت الأعمار الزمنية المقدرة لـ 24 أنيابًا حسب تعداد GLGs من 5 إلى 69 عامًا (الجدول 1) واستخدمت لتحديد الارتباطات بين العمر و rTL وقياسات شكل الجسم.

هوية شخصية معلومات الجدل معلومات الجسم العمر * (سنة)
التاريخ (شهر / يوم / سنة) موقع الجنس الطول (سم) الجسم (كلغ)
307 24 يناير 2010 جزيرة ليبونج ، ترانج أنثى 277 358 54
300 5 أكتوبر 2009 سمران بيتش ، ترانج أنثى 224 235 11
299 28 سبتمبر 2009 جزيرة ليبونج ، ترانج أنثى 281 335 63
292 2/2009 شاطئ آو نانغ ، كرابي أنثى 282 305 41
291 1 فبراير 2009 جزيرة كو ساراي ، ساتون أنثى 263 317 67
285 26 يوليو 2008 خريطة تا فوت ، رايونغ أنثى 200 24
283 9 أبريل 2005 جزيرة كو لانتا ياي ، كرابي أنثى 300 38
272 30 أغسطس 2007 ساتاهيب ، تشونبوري ذكر 245 13
258 12 أغسطس 2006 بانغ ساري ، تشونبوري أنثى 231 200 12
243 26 ديسمبر 2004 جزيرة كو با يونغ ، فانجنجا ذكر 275 310 23
236 1 يونيو 2004 جزيرة كو كلانج ، فانجنجا أنثى 250 69
234 22 أبريل 2004 جزيرة كو ياو ، فانجنجا أنثى 256.5 297 27
143 28 نوفمبر 2001 جزيرة ليبونج ، ترانج أنثى 199.5 142 5
129 6 ديسمبر 2000 خاو ماي كايو ، ترانج أنثى 225 258 43
098 14 أكتوبر 1998 كرام ، رايونج ذكر 214 180 16
084 3 أغسطس 1998 ويتشيت ، فوكيت ذكر 219 184 8
078 19 مايو 1998 لاماي ، شومفون أنثى 231 151 34
058 6 يناير 1997 جزيرة ليبونج ، ترانج ذكر 250 245 15
057 2 يناير 1997 جزيرة ليبونج ، ترانج أنثى 258 281 14
048 3 مارس 1996 سوك سمران ، رانونج أنثى 271 293 43
047 25 يناير 1996 جزيرة كو ياو ، فانجنجا ذكر 221 143 6
038 21 يونيو 1995 جزيرة ليبونج ، ترانج ذكر 257 250 14
036 31 مارس 1995 بو هين ، ترانج أنثى 273 272 34
016 11 مايو 1993 موانج كرابي ، كرابي ذكر 254 16

تحديد التباين في قياس rTL

في هذه الدراسة ، اختبرنا تباين قياس rTL باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي وما إذا كان ناتجًا عن اختلافات في التصميم التجريبي أو العوامل البيولوجية كما هو موضح في الجدول 2. كشفت نتائجنا عن سيرة ذاتية أقل تم الحصول عليها من عينات فردية عبر كلا العمرين. المجموعات مقارنة بالقيم بين الأفراد. تشير هذه النتائج إلى أنه على الرغم من وجود تباين كبير نسبيًا في خطأ التجربة ، يبدو أن العامل البيولوجي (الأعمار) هو العامل الرئيسي الذي يفسر التباين في rTL.

المسرح داخل الفرد (٪) بين الأفراد (٪)
سابق لأوانه (& lt20 سنة) 38.97 47.02
ناضجة (20 سنة) 37.44 91.65
المتوسط ​​العام 38.20 69.34

العلاقة بين العمر وتعداد GLG و rTL وقياس شكل الجسم

تم عزل الحمض النووي من 24 عينة من جلد أبقار البحر لقياس طول التيلومير بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي ، ومع ذلك ، كان هناك تضخيم إيجابي لـ 14 عينة فقط (56٪). لكن جميع أنياب الأطوم البالغ عددها 24 قد تقدمت في العمر بناءً على تعدادات GLGs. باستخدام الانحدار اللوجستي ، تم العثور على ارتباطات موجبة بين العمر المقدّر بواسطة تعداد GLG وكلا من وزن الجسم وطوله ، بقيم محددة تبلغ حوالي 309 كجم و 266 سم ، على التوالي (الشكلان 3 أ و 3 ب الجدول 3). على النقيض من ذلك ، فإن العلاقة بين العمر حسب عدد GLG و rTL تتناسب مع منحنى لوجستي سلبي ، لذلك ارتبط تقدم العمر بتناقص أطوال التيلومير (الشكل 3C ، الجدول 3). ولوحظ وجود ارتباطات سلبية بين rTL ووزن الجسم وطوله ، مع تعديلها ر 2 من 0.43 (ص & lt 0.0001) و 0.51 (ص & lt 0.0001) ، على التوالي ، لدالة لوغاريتم النموذج (الشكلان 3D و 3E الجدول 3). تم ربط وزن الجسم وطوله بشكل إيجابي مع التعديل ر 2 من 0.78 (الشكل 3F الجدول 3). بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتقييم أداء النموذج الذي تم الحصول عليه من تحديد العمر بواسطة rTL باستخدام الانحدار الخطي لاختبار الارتباط بين العمر المتوقع من rTL والعمر من تعداد GLG ، مما أدى إلى ر 2 من 0.86 والخطأ المعياري المتبقي 6.33 (الشكل S1).


شاهد الفيديو: كيف اكل اكثر من دون ما اتخن! تحسين سرعة الايض (كانون الثاني 2022).