معلومة

اختيار LacZ: المستعمرات الزرقاء على الرغم من ربط الإدراج

اختيار LacZ: المستعمرات الزرقاء على الرغم من ربط الإدراج


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

تم اقتراح أن البكتيريا المحولة باستخدام ناقل pBlueScript ، والتي تحتوي على إدخال في منتصف جين lacZ ، لا يزال بإمكانها إعطاء اللون الأزرق على X-gal ، إذا كان الإدخال صغيرًا ومربوطًا في الإطار مع جين lacZ (المصدر : المقرر الدراسي الخاص بي ، ResearchGate).

لا أفهم كيف من الممكن ألا تنتهي الترجمة عند كود الإيقاف المشفر بواسطة الإدخال. هل هذا شيء له علاقة بإنهاء تسرب؟ علاوة على ذلك ، حتى إذا كان إنهاء التسريب ممكنًا ، فهذا يعني أن هناك دائمًا فرصة بنسبة 1 من 3 للإدراج في الإطار.


ستؤدي معظم الإدخالات إلى تعطيل تعبير beta-gal (عن طريق تغيير إطار القراءة وإدخال رموز التوقف) وبالتالي إزالة النشاط الأنزيمي المطلوب لشق X-gal وإنتاج اللون الأزرق.

يتفق مصدرك معك - سيؤدي إدخال رمز إيقاف إلى إيقاف الترجمة (وليس النسخ) والحفاظ على اللون الأبيض.


الكثير من المستعمرات لكنها & # 39 كلها زرقاء & # 33 - هل أحتاج إلى ضبط نسب الربط؟ (مايو / 03/2007)

المتجه هو pCR2.1 (أو يسمى pCRDNA2.1؟ إنه & # 39s بواسطة Invitrogen) متجه TA بسيط مع تحديد أزرق / أبيض على الأمبيسلين. أنا افترض النهايات مزوَّدة بالفوسفور.
عندما أتحول ، أحصل على الكثير من المستعمرات لكنها كلها تقريبًا زرقاء. تُظهر شاشة المستعمرة (M13 PCR) منتجًا صغيرًا جدًا ، وربما ناقل فارغ ، لجميع المستعمرات البيضاء والمستعمرات الزرقاء التي أعرضها أيضًا.

إذن: كفاءة التحول اللائقة ، ولكن النواقل. الربط الذاتي؟

عادةً ما تكون ردود أفعال الربط:
عازلة 2ul (5x)
0.5ul T4 يغاز
0.5ul ناقلات
2ul إدراج
5ul الماء

ربط 5 دقائق @ درجة حرارة الغرفة ، وتحويل 4ul

لذا ، ربما يكون الإدخال الخاص بي: نسبة المتجه ليست عالية بما يكفي؟ الملحق عبارة عن منتج PCR يتم تنظيفه من مادة هلامية. هل هي مجرد مسألة تجربة نسب مختلفة؟

تحرير: يجب أن أذكر أن هذه هي المرة الأولى التي أستخدم فيها pCRDNA 2.1 - عادةً ما أستخدم pGEM-T لكنني نفدت. لا أعرف كم عمر أنبوب pCRDNA 2.1. حتى الآن لا أحب متجه الاستنساخ هذا كثيرًا - لم يمنحني أي شيء سوى المتاعب

لدي & # 39t استنساخ TA لعدة سنوات ، ولكن إذا كنت على حق ، فهذا ناقل ذو نهايات لزجة وإذا كان هذا صحيحًا ، فعندئذٍ لدي الإجابة عليه. تكمن المشكلة في أن ذيل إدراج poly A & # 39s يكون فضفاضًا أثناء تنظيف الهلام ، لذلك لا توجد طريقة يمكن أن يحدث فيها الربط. لا تحتاج إلى تنظيف الملحق إذا كان هناك منتج PCR واحد فقط.

فقط للتأكد ، أنت تستخدم Taq polymerase لجعل منتج PCR صحيحًا؟ لا يوجد دليل على قراءة البوليميراز هنا.

هل تعرف مقدار الإدخال الذي تضيفه؟ هل توجد مشكلات في استرداد المنتج من مجموعة أدوات التنظيف؟

إذا كان رد فعل PCR نظيفًا (نطاق واحد فقط (منتجك) ، وخالي من أي نطاقات ثانوية) ، فقد تكون فكرة استنساخ TA مباشرة لمنتج PCR الخاص بك. كلما طال انتظار منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، زادت احتمالية أن تبدأ في فقد A المتراكمة.

أيضًا ، هل لا يزال T4 ligase على وجه الخصوص ومخزن ligase في حالة جيدة؟ ينفجر Ligase T4 بسهولة إلى حد ما ولا يشبه المخزن المؤقت Ligase دورات ذوبان الجليد. ينفجر ATP الموجود في المخزن المؤقت.

نظرًا لأن هذا هو استنساخ TA ، فإن المتجه له تراكب T ، مما يمنع الارتباط.

قائمة بالأشياء المتعلقة باستنساخ TA
يعتمد استنساخ TA على بوليميراز Taq مضيفًا المزيد من A 3 & # 39 إلى منتج PCR.
تضيف Taq في المتوسط ​​فقط A واحد إلى 70٪ من منتجات PCR التي تصنعها.
يفضل معظم الناس استخدام منتج PCR جديد (موصى به أيضًا من خلال البروتوكول) حيث يسقط A overhang بعد فترة.
دليل على قراءة منتجات البوليميراز غير حادة نهاية منتجات PCR.

يمكنك أيضًا اختبار بعض المستعمرات الزرقاء لإدخالها. اعتمادًا على ما تقوم باستنساخه ، يمكن أن يحدث التعبير عن LacZa النشط حتى مع الإدراج.

هذا صحيح جدا. إذا كان الإدخال صغيرًا وبقليل من الحظ في الإطار مع جين lacZ. بعد كل النهايات N لبروتين LacZ ليست مهمة جدًا ، مما يسمح بإدخال موقع الاستنساخ المتعدد في الجين في المقام الأول.

أتمنى لو لم يكن علي & # 39t أن أقوم بتنقية الهلام & # 33 لسوء الحظ ، لم أحظى بالكثير من الحظ مع PCR الخاص بي في الأسابيع القليلة الماضية ، وغالبًا ما أحصل على نطاقات متعددة (إذا تعرفت على اسم المستخدم الخاص بي ، فأنا ما زلت أعمل على ذلك الرتق التجمع PCR - لقد عملت بشكل جيد في المرات القليلة الأولى & # 33)

أقوم دائمًا بفحص جميع مستعمراتي البيضاء وبعض المستعمرات الزرقاء من أجل قياس جيد. عندما كنت أستخدم إنزيمًا مصححًا لتجميع PCR وربطه في pCRBLUNT ، اضطررت إلى فحص الكثير من الأكواد الزرقاء لأن الإدخال الخاص بي هو 88 رمزًا بالضبط (لذلك لا يزال LacZ في الإطار). مع ناقل TA ، ليس في الإطار ، لكنني ما زلت أتحقق منه.

من الناحية النظرية ، نعم & # 33 لكنني تقدمت بالفعل وقمت بتسلسل إحدى مستعمراتي التي اعتقدت أنها كانت إيجابية وعاد التسلسل مع ناقل TA تم إعادة ربطه بشكل مثالي. كانت Ts الإضافية مفقودة. من المفترض أن يكون المتجه قديمًا وكان يفقد نقطة الصفر الخاصة به. كان هذا هو pGEM-T الذي نفد منه منذ ذلك الحين. ولكن كما قلت ، لا أعرف كم عمر pCR2.1 الخاص بي ، فربما يكون أسوأ؟

يعتبر ligase حديثًا جدًا وأنا أقوم بتقسيم صغير من محلول ligase المؤقت (في أنابيب PCR) لتقليل التجميد المتكرر. على أي حال ، يبدو أن الربط يعمل على إغلاق متجه TA.

يبدو أن منتج PCR الخاص بي ربما لا يحتوي على أي ذيول A. يجب على الرغم من ذلك

هناك ورقة تميزوا فيها (ربما رأيتها أنت & # 39). لقد شعرت بالإثارة عندما فكرت في أنني وجدت مشكلتي ، لكن لا ، لقد ألقيت نظرة مختصرة وأن كتابي التمهيدي قريب إلى حد ما من الإجماع المنشور في تلك الورقة ، لذلك يجب أن يكون لها حقًا ذيول أ.
ربما فقدت ذيول أ؟ ربما ، لكنني حاولت تكرار محاولات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ولا يبدو أنه يصلح الأمور.

على أي حال ، يبدو أنني فكرت في كل نفس الأشياء مثلكم يا رفاق. التفكير في الأمر مرة أخرى الآن ربما يكون شيئًا ما له علاقة بنتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل السيئة حقًا بدلاً من ظروف الربط. إنها علامة سيئة عندما تحصل عيناتي على فرقة ولا يوجد شيء في الجانب السلبي ولكن لا شيء في عنصر التحكم الإيجابي أيضًا & # 33

حسنًا ، شكرًا لمساهمتك & # 33

عند استخدام عدة تجارية ، عادة ما يكون لديك فرصة جيدة للربط. تحقق من خلال النيتروجين وأخبرهم.

على الرغم من أنه لا ينبغي ربط النفس. لكن بطريقة ما يصعب الحكم. إذا استمرت المشكلة ، فربما يمكنك التحقق من منتجات PCR الخاصة بك. تسلسلها أو شيء من هذا القبيل. نعم. أنا أتفق معك. أنا أشك في منتجات PCR الخاصة بك بدلاً من ذلك. هتافات.

إذا كان المتجه قديمًا أو تم تخزينه بشكل سيئ ، فربما يكون قد فقد العديد من تراكمات T المتراكمة. خلافًا لذلك ، نظرًا لأنك تقول إنه يجب عليك تنقية منتج PCR الخاص بك ، فهل لديك ما يكفي من الحمض النووي بعد التنقية؟ أو ، حاول إضافة A المتدلية بعد التنظيف؟

لا أعرف ما إذا كان لدي الوقت لإعادة النظر في هذا الربط (الأطروحة مستحقة في أسبوعين) ، لكن أشخاصًا آخرين واجهوا مشكلة مع تفاعل البوليميراز المتسلسل ، لذا ربما يكون السبب هو السبب.

في المرة القادمة التي أقوم فيها بالاستنساخ ، سأقوم بعمل PCR ذو النهاية اللاصقة & # 33 & # 33 بدون عمليات هضم ولا نواقل TA & # 33

هههه .. كل التوفيق لأطروحتك. Erm. يجب أن أقول إن استنساخ TA سهل مقارنة بالآخرين.


فحص الأزرق والأبيض في المختبر

اكتشف العلماء أن حذف قسم من ملف لاكز ينتج الجين (طفرة تسمى lacZΔM15) إنزيم β-galactosidase غير وظيفي. توفير ترميز الحمض النووي لهذا القسم من الأحماض الأمينية (يسمى α-peptide) لخلية بكتيرية lacZΔM15 متحولة في العابرة يكمل الطفرة التي تسمح بإنزيم وظيفي. هذه العملية تسمى α- التكميل.

تم وضع النظام الموصوف أعلاه للاستخدام العملي بالطريقة التالية. صمم العلماء موقع استنساخ متعدد (MCS) في α-peptide (يتم تمثيله على شكل إسفين برتقالي في الشكل الموجود على اليسار) وأدخلوه في بلازميد ، مما أدى إلى إنشاء ناقل استنساخ مكمل α. عندما يتم التخطيط لتفاعل الاستنساخ ويتم استنساخ الحمض النووي (الأحمر) في MCS هذا ، يتم مقاطعة α-peptide كما هو موضح في الخلية A ، وبالتالي لن يكمل طفرة β-galactosidase في الخلية. يؤدي تفاعل الاستنساخ غير الناجح إلى ترك α-peptide سليمًا ، وبالتالي سيكون للخلية إنزيم β-galactosidase الوظيفي من خلال تكملة α (الخلية B).

كما هو موضح على اللوحة التمثيلية إلى اليمين ، تحتوي المستعمرات التي تحتوي على بلازميد يحتوي على مادة β-galactosidase غير وظيفية ، وتظل اللون الكريمي الأبيض الجميل للمعيار بكتريا قولونية. من ناحية أخرى ، ينتج β-galactosidase السليم صبغة من x-gal (المدرجة في وسط لوحة التحويل) ، مما يحول المستعمرة البكتيرية إلى اللون الأزرق. يجب أن نلاحظ أن IPTG مدرج أيضًا في الوسيط لضمان نسخ ملف لاك أوبرون.


اختيار المستعمرة اللوني الآلي: فحص مستعمرة الأزرق والأبيض مع سلسلة QPix 400

يعد فحص المحولات البكتيرية التي تحتوي على البلازميدات المؤتلفة مع إدخالات الجينات المستنسخة خطوة أساسية في الاستنساخ الجزيئي. تسمح طريقة المراسل اللونية المسماة "الفرز الأبيض والأزرق" بتحديد المستعمرات المؤتلفة وغير المؤتلفة بناءً على اللون. على الرغم من أن الفحص باللونين الأزرق والأبيض يوفر تحديدًا مرئيًا للمستعمرات المحولة المؤتلفة ، إلا أن العديد من الخطوات اليدوية في عملية انتقاء القولون ذاتية وبطيئة وعرضة للخطأ.

تقدم سلسلة QPix ™ 400 من Molecular Devices للأجهزة الميكروبية حلاً آليًا مصممًا خصيصًا للفحص اللوني الأزرق والأبيض الدقيق باستخدام التصوير بالضوء الأبيض وللمراقبة الفعالة لكفاءة التحول. يتضمن الحل وحدة QPix ™ Software 2.0 Blue-White Picking ، وهي تقنية QPix ™ ضوئية

مرشحات كروما ، وحوامل لوحة مصدر قابلة للتعديل. يصف تسليط الضوء على هذا التطبيق نتائج تجربة فحص المستعمرة اللونية لإثبات المفهوم باستخدام نظام QPix ™ 420. تم التحقق من دقة المستعمرات المختارة عن طريق تسلسل الحمض النووي.

مبادئ الفحص بالأزرق والأبيض

تعتمد الآلية الجزيئية لفحص المستعمرة الزرقاء والبيضاء على لاكز الجين المراسل. في هذه التقنية ، المستعمرات غير المؤتلفة وظيفية لاكز يتحول ترميز الجين لـ ß-galactosidase إلى اللون الأزرق في وجود وسائط ثقافية تحتوي على X-gal. هذا على النقيض من كيفية تأشيب المستعمرات مع اضطراب لاكز يتحول الجين الناتج عن إدخال الجينات الناجح إلى اللون الأبيض (الشكل 1).

الشكل 1. الاستنساخ الجزيئي. تمثيل تخطيطي لإجراء فحص نموذجي باللونين الأزرق والأبيض. يتضمن الفحص الأزرق والأبيض للمستعمرات البكتيرية استنساخ الجين الذي يتم إدخاله في ناقل بلازميد بمقاومة للمضادات الحيوية و لاكز الجين المراسل. يؤدي ربط الإدخال في موقع الاستنساخ المتعدد للناقل إلى تعطيل نشاط لاكز الجين. التحول من المختصة بكتريا قولونية مع المزيج المرتبط في وجود X-gal في وسط الاستزراع ينتج عنه تكوين مستعمرات زرقاء وبيضاء.

استخدام الاستنساخ الجزيئي لعدوى المستعمرات بالجين المعني

لإنشاء بنية نموذجية ، تم استنساخ جين عامل النمو الشبيه بالأنسولين البشري (IGF) في موقع الاستنساخ المتعدد (MCS) لمتجه البلازميد المستنسخ pUC57-Kan الذي يحتوي على مقاومة كانامايسين و لاكز الجين (الشكل 2 أ). مختص كيميائيا بكتريا قولونية (One Shot® TOP10 ، Life Technologies) تم تحويلها باستخدام ناقل مترابط ومزيج الجين (Human IGF). تم بعد ذلك طلاء البكتيريا المحولة على وسط LB يحتوي على كاناميسين و IPTG و X-gal وحضنت طوال الليل عند 37 درجة مئوية. تم تحديد المستعمرات التي تحتوي على ناقلات مع وبدون الجين المُدرج باللون الأبيض أو الأزرق ، على التوالي ، باستخدام نظام QPix 420 (الشكل 2 ب).

الشكل 2. استنساخ IGF البشري في ناقلات البلازميد استنساخ pUC57-Kan وفحص مستعمرة الأزرق والأبيض. (أ) تم ربط إدخال الجين ، IGF البشري ، في MCS لناقل استنساخ البلازميد pUC57-Kan. (ب) تظهر المستعمرات الزرقاء والبيضاء على لوحات الوسائط LB التي تحتوي على X-gal نتيجة لاكز التعبير الجيني القائم على المراسل المستخدم في فحص مستعمرة الأزرق والأبيض.

تم وضع حاملي لوحة المصدر القابلة للتعديل الذين يحملون ألواح بتري تحتوي على مستعمرات بكتيرية على سرير التصوير باستخدام مرشح QPix Chroma (الشكل 3 أ). عقدت بتريبلاتس بشكل آمن بواسطة المزالج القابلة للتعديل على حاملي اللوحة (الشكل 3 ب) وتم تصويرها باستخدام الضوء الأبيض (الشكل 3 ج).

الشكل 3. فحص مستعمرة الأزرق والأبيض باستخدام أنظمة QPix (أ) مرشحات QPix Chroma الضوئية لتحسين تمايز الألوان و (ب) حاملات لوحة مصدر قابلة للتعديل لتحسين مرونة الأدوات البلاستيكية. تم تصوير المستعمرات تحت الضوء الأبيض (ج) يتم تحليلها بواسطة البرنامج.

التحديد التلقائي للمستعمرات الزرقاء أو البيضاء

تم تحليل صور الضوء الأبيض التي تم التقاطها على نظام QPix 420 باستخدام برنامج QPix Software 2.0 سهل الاستخدام. تم تحديد المستعمرات الزرقاء (الشكل 4 أ) أو الأبيض (الشكل 4 ب) تلقائيًا واختيارها بشكل منفصل باستخدام ميزة التحديد التلقائي المضمنة (الشكل 4 ج). يمكن للمستخدم ضبط عتبة الرسم البياني وتحديد معايير اختيار المستعمرة ، مثل الانضغاط ونسبة المحور والقطر والقرب يدويًا لتحسين التحديد. تم اختيار المستعمرات الزرقاء والبيضاء المختارة آليًا باستخدام رأس الالتقاط الذي يعمل بالهواء المضغوط بالكامل والذي يحتوي على 96 سنًا في نظام QPix 420.

الشكل 4 (أ) يُشار إلى المستعمرات الزرقاء النموذجية المحددة باستخدام التحديد التلقائي للأزرق بأسهم زرقاء. (ب) يُشار إلى المستعمرات البيضاء التي تم تحديدها باستخدام التحديد التلقائي للأبيض بأسهم بيضاء. (ج) تسمح مرونة البرنامج بالتعديل اليدوي لعتبة الشدة لتحسين النتائج ، مثل تحديد المستعمرات الزرقاء التي تعمل بالطاقة.

تأكيد تسلسل الحمض النووي للمستعمرات المختارة

تم تأكيد دقة الانتقاء اللوني وانتقاء المستعمرات الزرقاء والبيضاء من خلال تسلسل الحمض النووي للتحقق من وجود الجين المدخل. أكد تضخيم الدائرة المتداول أن 98 ٪ من المستعمرات البيضاء المختارة احتوت على إدخال الجين المستنسخ ، IGF البشري ، في ناقل بلازميد استنساخ pUC57-Kan. بالإضافة إلى ذلك ، احتوت 100٪ من المستعمرات الزرقاء المختارة على ناقل استنساخ pUC57-Kan فارغ بدون الجين المُدخل. توفر نتائج هذه التجربة ثقة مقنعة في تأكيد التمايز اللوني بين اختيار المستعمرة البيضاء والزرقاء باستخدام سلسلة QPix 400 من جامعات المستعمرات الميكروبية.

ملخص

فحص مستعمرات الأزرق والأبيض هو طريقة للكشف اللوني تسمح بالتمييز المناسب للمستعمرات المؤتلفة المحولة التي تؤوي إدخال الجين نتيجة للاستنساخ الجزيئي. تقدم Molecular Devices حلاً آليًا مصممًا خصيصًا للفحص الأزرق والأبيض على سلسلة QPix 400 من جامعات المستعمرات الميكروبية الآلية. تتيح واجهة البرنامج سهلة الاستخدام لبرنامج QPix Software 2.0 ، جنبًا إلى جنب مع المرشحات الضوئية ، تمايزًا دقيقًا وقويًا للألوان في الضوء الأبيض. تعمل الملحقات مثل حاملات الألواح المزودة بمزالج قابلة للتعديل على تحسين توافق الأدوات البلاستيكية. وبالتالي ، توفر سلسلة QPix 400 بديلاً عالي الكفاءة وموثوقًا للنُهج التقليدية القائمة على الألوان لفحص المستعمرات.


2 مناقشة (35٪)

2.1. إذا كان إنزيم التقييد يقطع الناقل جزئيًا فقط ويُدخل الحمض النووي ، (1) كيف ستعرف ذلك ، و (2) كيف سيؤثر على الربط؟ اشرح إجاباتك واربطها بنتائجك. (حد 150 كلمة) (0.6 درجة)

إذا تم قطع المتجه HindIII جزئيًا ، فإنه سيترك مجموعتين من الشظايا ، مقطوعة تمامًا أو متجهة سليمة. يُنتج الملحق ، Lambda ، مواقع تقييد إما مقطوعة أو غير مقطوعة. هذا بدوره سيؤثر على الربط حيث يصعب اكتشاف الخيوط التكميلية أو عدم اكتشافها على الإطلاق. يمكن استخدام الرحلان الكهربي للهلام للتحقق من مدى جودة القطع المتجه والإدخالات من خلال النظر في أحجام الأجزاء المتوقعة من صور الهلام (Ditta، Stanfield، Corbin & ampamp Helinski، 1980)

2.2. كيف تستبعد أن الخلايا المختصة بها ملوثات مقاومة للأمبيسيلين والتي ولدت المستعمرات في عمليات الربط 1-3؟ (حد 60 كلمة) (0.6 درجة)

لكي ينمو أي جزيء DNA ويشكل مستعمرات ، يجب أن يحتوي على جينات مقاومة للأمبيليسيلين. مقال التحول البكتيري واختيار الأمبير. (بدون تاريخ) ذكر أن الإدخال الخطي للحمض النووي ، وناقلات القطع ، والبلازميدات المؤتلفة ، والبلازميدات غير المؤتلفة هي مخاليط الربط التي يجب أن تكون صفيحة. الربط 4 وهو عنصر التحكم السلبي هو البلازميدات الوحيدة التي لن تشكل مستعمرات. ومن ثم يمكن استبعاده.

2.3 إذا لم تكن هناك محولات من عمليات الربط 1-3 ، فماذا يمكن أن تكون المشكلة؟ هل يمكن أن تكون مشكلة في عملية التحويل أو الربط ، وكيف يمكنك تمييز ذلك؟ (حد 60 كلمة) (0.6 درجة)

إذا لم تكن هناك محولات من عمليات الربط 1-3 ، فقد يكون ذلك بسبب التلوث المتبادل. إن وجود تلوث مقاوم للأمبيسيلين من شأنه أن يستبعد الأخطاء المحتملة في لوحة أجار. بخلاف الرحلان الكهربي للهلام ، فإن الممر 5 ، الذي يمثل المستعمرة البيضاء 1 البلازميدات المقطوعة باستخدام EcoRI من شأنه أن يشكل مستعمرات إذا حدث التحول.

2.4 كيف ينتج المتجه المعاد تدويره والبلازميدات المؤتلفة مستعمرات ملونة مختلفة في هذه التجربة؟ اشرح إجابتك (حدد 100 كلمة) (0.6 درجة)

في البلازميدات المؤتلفة ، جينات LacZ هي الفرق الأساسي. نظرًا لكونها مقاومة للأمبيسيلين وتحتوي على جين lacZ ، عند إدخاله في جين LacZ ، سيكون غير نشط. وفقًا لبحث أجرته Ditta و Stanfield و Corbin و Helinski (1980) ، فإن هذا يعطل إنتاج b-galactosidase الذي سيشكل بدلاً من ذلك مستعمرات بيضاء. أما بالنسبة للناقل المعاد تدويره ، فإن جين lacZ لا ينقطع وهو كذلك


يسمح استنساخ البلازميد بعزل شظايا الحمض النووي من الخلائط المعقدة

يمكن إدخال جزء DNA من بضعة أزواج قاعدية يصل إلى & # x0224820 كيلو بايت في ناقل بلازميد. عندما يحول مثل هذا البلازميد المؤتلف بكتريا قولونية الخلية ، فإن جميع الخلايا السلالة المقاومة للمضادات الحيوية التي تنشأ من الخلية الأولية المحولة ستحتوي على بلازميدات بنفس التسلسل المُدرج للحمض النووي (الشكل 7-3). يتم نسخ الحمض النووي المُدخَل مع باقي DNA البلازميد ويتم فصله إلى الخلايا الوليدة مع نمو المستعمرة. بهذه الطريقة ، يتم نسخ الجزء الأولي من الحمض النووي في مستعمرة الخلايا إلى عدد كبير من النسخ المتطابقة. نظرًا لأن جميع الخلايا في مستعمرة تنشأ من خلية أبوية واحدة محولة ، فإنها تشكل نسخة من الخلايا. يشار إلى الجزء الأولي من الحمض النووي الذي يتم إدخاله في البلازميد الأبوي باسم الحمض النووي المستنسخ لأنه يمكن عزله عن استنساخ الخلايا.

الشكل 7-3

الإجراء العام لاستنساخ جزء من الحمض النووي في ناقل بلازميد. على الرغم من عدم الإشارة إليه باللون ، إلا أن البلازميد يحتوي على أصل النسخ المتماثل وجين مقاومة الأمبيسلين. امتصاص البلازميدات بكتريا قولونية يتم تحفيز الخلايا بتركيزات عالية من CaCl (المزيد).

يسمح استنساخ الحمض النووي بعزل أجزاء من الحمض النووي ذات تسلسل نيوكليوتيد معين من خليط معقد من الأجزاء ذات التسلسلات المختلفة. كمثال بسيط ، افترض أن لديك محلولًا يحتوي على أربعة أنواع مختلفة من أجزاء الحمض النووي ، ولكل منها تسلسل فريد (الشكل 7-4). يتم إدخال كل نوع من أنواع الشظايا بشكل فردي في ناقل بلازميد. يتم تحضين الخليط الناتج من البلازميدات المؤتلفة مع بكتريا قولونية يتم زرع الخلايا في ظروف تسهل التحول للخلايا على أطباق انتقائية من المضادات الحيوية. نظرًا لأن كل مستعمرة تتطور نشأت من خلية واحدة أخذت بلازميدًا واحدًا ، فإن جميع الخلايا في مستعمرة تؤوي نوعًا متطابقًا من البلازميد الذي يتميز بجزء الحمض النووي الذي تم إدخاله فيه. نتيجة لذلك ، يتم عزل نسخ من شظايا الحمض النووي في الخليط الأولي عن بعضها البعض في المستعمرات البكتيرية المنفصلة. وبالتالي ، فإن استنساخ الحمض النووي هو طريقة قوية ، لكنها بسيطة لتنقية جزء معين من الحمض النووي من خليط معقد من الأجزاء وإنتاج أعداد كبيرة من الجزء المعني.

الشكل 7-4

عزل شظايا الحمض النووي من خليط بالاستنساخ في ناقل بلازميد. يتم إدخال أربعة أجزاء متميزة من الحمض النووي ، مصورة بألوان مختلفة ، في نواقل استنساخ البلازميد ، مما ينتج عنه مزيج من البلازميدات المؤتلفة يحتوي كل منها على جزء واحد من الحمض النووي. (أكثر. )


الاستنساخ الخطوة 2: المتجه والربط البلازميدات عبارة عن قطع دائرية خارج الصبغية من الحمض النووي المزدوج الشريطة الموجود في بعض البكتيريا. تستخدم البلازميدات طاقة الخلايا البكتيرية ومسارات التمثيل الغذائي لتكرار نفسها. لكي يكون البلازميد مفيدًا كناقل ، يجب أن يكون صغيرًا بشكل معقول لسهولة نقله إلى الخلايا البكتيرية وأن يكون قادرًا على تكرار نفسه بأعداد كبيرة.

يجب اختيار البلازميد مع موقع تقييد مطابق لمواقع التقييد في الحمض النووي الغريب. إذا تم علاج البلازميد والحمض النووي الأجنبي بنفس نوكلياز القيد الداخلي ، فإن "النهايات اللاصقة" ، أو تنتهي بـ 5 'أو 3' نتوءات متدلية ، من الحمض النووي الغريب سوف تلتصق أو تعيد الانغلاق على الأطراف اللاصقة للبلازميدات. وهكذا يتم إدخال جزء الحمض النووي في ناقل البلازميد. يقوم الإنزيم الثاني ، DNA ligase ، بإصلاح التشققات في الخيوط. DNA Ligase هو إنزيم مطلوب أثناء تكرار الحمض النووي لإصلاح الفواصل في الحمض النووي وكجزء من آلية إصلاح الحمض النووي لدينا.

كما ذكرنا سابقًا في المجموعة الفرعية للوحدة II-b ، يمكن استنساخ أمبليكونات PCR مباشرةً دون هضم النهايات ، ولكن غالبًا ما يكون إنشاء "نهايات لزجة" أكثر نجاحًا. يجب التخطيط لمثل هذه النهايات لتضمينها في البادئات (انظر قسم PCR في تسلسل الحمض النووي).

بناء ناقل الاستنساخ المؤتلف & # 8211 مركز التدريب على التكنولوجيا الحيوية بجامعة كالجاري


المقدمة

يتم استنساخ الحمض النووي تقليديًا عن طريق هضم مصدر البلازميد أو جزء الحمض النووي وناقل متلقي مع إنزيمات تقييدية ، واستخراج الأجزاء المهضومة من مادة هلامية ، وربط الأجزاء المنقاة باستخدام DNA ligase (انظر البروتوكولات الحالية مقالة Struhl ، 1991). هذا النهج مناسب لربط جزء أو جزأين من الحمض النووي في ناقل ، لكنه لا يعمل بشكل جيد لربط أجزاء متعددة في متجه في خطوة واحدة. لحسن الحظ ، تتوفر طرق استنساخ جديدة تسمح بتجميع عدة شظايا في متجه في خطوة واحدة ، بما في ذلك طرق الاستنساخ القائمة على التماثل (على سبيل المثال ، تجميع Gibson) والطرق التي تعتمد على نوع إنزيمات تقييد IIS ، مثل استنساخ Golden Gate (المسمى في إشارة إلى استنساخ البوابة ، ولكن أيضًا كلعب مع اسم الجسر). يتم تنفيذ Golden Gate باستخدام تفاعل تقييد-ربط في دورة حرارية. يتم وصف معلمات إعداد وتنفيذ تفاعل تجميع Golden Gate القياسي في البروتوكول الأساسي 1 والموضحة في الشكل 1. يتطلب استنساخ Golden Gate أن يكون للمتجه والإدخالات بنية محددة فيما يتعلق بوجود أو عدم وجود مواقع تقييد محددة. يتم توفير طريقة لتحويل متجه الاستنساخ العادي إلى متجه استنساخ متوافق مع Golden Gate في البروتوكول الأساسي 2. يتم توفير مثال لاستيعاب إدخال لاستنساخ Golden Gate في البروتوكول الأساسي 3 ، والذي يشرح كيفية تصميم الاشعال للتضخيم والاستنساخ لجين مهم في ناقل Golden Gate.

إن إنشاء وحدات نسخ محددة والتجميع اللاحق لوحدات النسخ في بنى متعددة الجينات باستخدام طرق الاستنساخ التقليدية ليست مهمة بسيطة. هذا لا يرجع فقط إلى تجميع الحمض النووي نفسه ، ولكن أيضًا بسبب صعوبة تصميم استراتيجيات الاستنساخ للتركيبات الكبيرة. أحد أسباب هذا القيد هو أن مواقع التعرف على إنزيمات التقييد المستخدمة في كل خطوة من خطوات الاستنساخ لا تزال موجودة عادة في التركيبات بعد الربط. لذلك ، يجب استخدام إنزيمات تقييد مختلفة لكل خطوة متتالية ، مما يجعل تخطيط استراتيجية الاستنساخ صعبًا للغاية أو مستحيلًا عند العمل مع عدد كبير من الجينات. يتم توفير حل لهذه المشكلة من خلال توحيد الأجزاء واستراتيجية التجميع ، جنبًا إلى جنب مع استخدام استنساخ Golden Gate لتجميع الحمض النووي في كل خطوة من خطوات الاستنساخ. يتم استخدام هذه الإستراتيجية بواسطة نظام الاستنساخ المعياري MoClo (Engler et al.، 2014 Weber، Engler، Gruetzner، Werner، & Marillonnet، 2011 Werner، Engler، Weber، Gruetzner، & Marillonnet، 2012). يعتمد نظام MoClo على استخدام الأجزاء القياسية التي يتم تصنيعها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، والمستنسخة في العمود الفقري المتجه ، والمتسلسلة. تحتوي الأجزاء القياسية على تسلسل الحمض النووي لعنصر وراثي أساسي ، مثل المحفز أو تسلسل الترميز أو المنهي. يوفر البروتوكول الأساسي 4 طريقة لاستنساخ أجزاء من منتجات PCR في خطوة واحدة (الشكل 1) ، ويوفر البروتوكول البديل طريقة لاستنساخ الأجزاء الأكبر في خطوتين متتاليتين. يسمح الهيكل القياسي للأجزاء بإعادة استخدامها في العديد من التركيبات المختلفة دون الحاجة إلى تضخيم PCR. كما يسمح بتوحيد إجراءات التجميع. يتم تجميع التركيبات متعددة الجينات من الأجزاء الأساسية باستخدام سلسلة من خطوات التجميع ذات وعاء واحد. تم وصف استراتيجية الاستنساخ وخطوات الاستنساخ المختلفة المستخدمة مع نظام MoClo في البروتوكول الأساسي 5.

1: أداء رد فعل نموذجي لاستنساخ البوابة الذهبية

يتكون مبدأ استنساخ Golden Gate من استخدام إنزيم تقييد IIS من النوع و ligase في ربط تقييد لتجميع العديد من أجزاء الحمض النووي بترتيب خطي محدد في متجه في خطوة واحدة (الشكل 2 أ). اكتب إنزيمات تقييد IIS تشق الحمض النووي خارج تسلسل موقع التعرف على الحمض النووي. على سبيل المثال ، موقع التقييد الخاص بـ بسأنا (GGTCTC N ↓ N1ن2ن3ن4) يتكون من تسلسل موقع التعرف على الحمض النووي (GGTCTC) وموقع انشقاق الحمض النووي (↓) مما يؤدي إلى تراكم الحمض النووي أحادي الجديلة 4 نانومتر (N1ن2ن3ن4) بعد الهضم. لكي تكون مناسبة لاستنساخ Golden Gate ، يجب أن تكون جميع أجزاء الحمض النووي محاطة بمواقع تقييد لأنزيم تقييد IIS من النوع ، مع اتجاه داخلي بحيث يتم قطع تسلسل موقع التعرف على الحمض النووي من شظايا الحمض النووي أثناء خطوة الهضم (الشكل 2 ب) . يجب أن يحتوي ناقل الوجهة أيضًا على موقعي تقييد لنفس النوع من إنزيم IIS ، ولكن مع اتجاه خارجي بحيث يتم أيضًا شق مواقع التعرف على الحمض النووي من المتجه بواسطة خطوة الهضم. أخيرًا ، يجب أن تكون جميع المتراكبات أحادية الجديلة 4-nt (وتسمى أيضًا مواقع الاندماج) في نهايات شظايا الحمض النووي والمتجه فريدة ومكملة للسماح بالتصلب حتى نهاية الجزء التالي أو المتجه. نظرًا لأن جزيء الحمض النووي المؤتلف الدائري المتوقع لا يحتوي على مواقع تقييد للإنزيم المستخدم ، فلا يمكن إعادة هضمه ، مما يسمح بإجراء التقييد والربط في نفس مزيج التفاعل. يسمح هذا لشظايا الحمض النووي التي تم ربطها مرة أخرى في العمود الفقري البلازميد الأولي الخاص بها بالخضوع لمزيد من دورات الهضم والربط حتى يتم دمجها أخيرًا في المنتج المؤتلف المطلوب (الشكل 2 ج). هذا مفيد لنقل جزء من ناقل إلى التالي ، ولكنه يزداد أهمية عند الحاجة إلى استنساخ عدة أجزاء في خطوة واحدة. وذلك لأن عدد أحداث الربط المحتملة يزيد بشكل كبير مع عدد البلازميدات في مزيج الربط ، في حين أن فرصة الحصول على منتج مرتبط بشكل صحيح في خطوة واحدة تصبح غير محتملة بشكل متزايد (الشكل 2 د). يؤدي ربط التقييد إلى كفاءة استنساخ عالية ويسمح بربط ما يصل إلى 24 شظية في تفاعل استنساخ واحد (Potapov et al. ، 2018).

يمكن أن تكون أجزاء الحمض النووي المستخدمة شظايا خطية تم الحصول عليها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ولكن يمكن أيضًا أن تكون متواليات مستنسخة في بلازميد دائري. يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء تفاعل استنساخ Golden Gate عندما يتوفر كل من أجزاء الحمض النووي وناقل الوجهة كبلازميدات.

المواد

  • تنقية DNA البلازميد:
    • متجه وجهة البوابة الذهبية (انظر البروتوكول الأساسي 2 أو متاح من Addgene أو باحثين آخرين)
    • إدراج (DNA البلازميد)
    • 10 يو / ميكرولتر بسأنا (نيو إنجلاند بيولابس ، القط رقم R0535L)
    • 10 يو / ميكرولتر بي بي آيأنا (Thermo Fisher Scientific، cat. no. ER1012)
    • 10 يو / ميكرولتر بي إس إمBI (نيو إنجلاند بيولابس ، القط رقم R0580s)
    • مقياس الطيف الضوئي (على سبيل المثال ، Nanodrop 1000 ، Peqlab)
    • 0.2 مل من ألواح PCR (Thermo Fisher Scientific ، القط رقم AB0600)
    • أختام لوحة PCR اللاصقة (Thermo Fisher Scientific ، رقم القط AB0588)
    • جهاز التدوير الحراري (على سبيل المثال ، C1000 Touch ، BioRad)
    • أنابيب ميكروسينتريفوج 1.5 مل
    • حاضنة بلوك 37 درجة و 42 درجة مئوية (على سبيل المثال ، Eppendorf ThermoMixer)
    • حاضنة 37 درجة مئوية وحاضنة شاكر
    • قوارير أو أنابيب الثقافة
    • برنامج تحليل الحمض النووي (على سبيل المثال ، Vector NTI ، Thermo Fisher Scientific)

    ملاحظة: اكتب إنزيمات IIS التي تولد تراكمًا ثلاثي الأبعاد عند الانقسام ، مثل إلغويمكن أيضًا استخدام I (Thermo Fisher Scientific ، القط رقم ER1931).

    أداء ربط التقييد

    1. قم بقياس تركيز الحمض النووي للبلازميدات الداخلة والمتجهة باستخدام مقياس الطيف الضوئي.

    2. أضف كميات متساوية من كل إدخال وناقل إلى خليط التفاعل. استخدم 20 fmol من كل بلازميد في حجم تفاعل إجمالي 15 أو 25 ميكرولتر على النحو التالي:

    • x1 µl ناقلات الحمض النووي
    • x2 إدراج 1
    • x3 إدراج 2
    • x4 إدراج 3
    • 1.0 ميكرولتر T4 DNA ligase
    • 0.5 ميكرولتر من نوع إنزيم IIS
    • 1.5 ميكرولتر 10 × عازلة ربط
    • ح2O إلى 15 ميكرولتر
    • x1 ناقلات µl
    • x2 إدراج 1
    • x3 إدراج 2
    • … …
    • xن إدراج µl ن
    • 1.5 ميكرولتر T4 DNA ligase
    • 1.0 ميكرولتر نوع انزيم IIS
    • 2.5 ميكرولتر 10 × عازلة ربط
    • ح2O إلى 25 ميكرولتر

    يتم حساب حجم كل بلازميد DNA بالصيغة: 20 (fmol) × الحجم (bp) / التركيز (ng / l) / 1520. إذا كان الحجم المحسوب منخفضًا جدًا لسحب الأنابيب الدقيقة (& lt0.3 ميكرولتر) ، فيجب تخفيف البلازميد 10 أضعاف في الماء ، ويجب إضافة حجم أكبر 10 أضعاف من هذا التخفيف.

    3. احتضان المزيج في دائري حراري بالشروط التالية:

    • 50 دورة: 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، 16 درجة مئوية لمدة 5 دقائق
    • 50 درجة مئوية لمدة 5 دقائق
    • 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق
    • 16 درجة مئوية

    عند استخدام BsaI ، يتم تنفيذ خطوة الهضم النهائية التي تبلغ مدتها 5 دقائق عند 50 درجة مئوية ، حيث يمكن لـ BsaI الهضم عند 37 درجة مئوية و 50 درجة مئوية. في المقابل ، عند استخدام BpiI ، لا تزال خطوة الهضم النهائية تتم عند 37 درجة مئوية ، حيث أن هذه هي درجة حرارة الهضم المثلى لهذا الإنزيم.

    تحويل المنتج إلى الإشريكية القولونية

    4. يضاف مزيج الربط الكامل (15 أو 25 ميكرولتر) إلى 50 ميكرولتر المختص بكتريا قولونية الخلايا واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة.

    5. صدمة الحرارة عند 42 درجة مئوية لمدة 90 ثانية. دع الخلايا تتعافى على الجليد لمدة 2 دقيقة.

    6. إضافة 500 ميكرولتر LB أو SOC المتوسطة واهتز الخلايا لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية في ThermoMixer.

    7. لوحة على لوحات LB تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة و X-gal. احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.

    لاستنساخ ردود الفعل مع واحد إلى ثلاثة إدراج ، لوحة 10-20 ميكرولتر. صفيحة ذات أحجام أكبر لزيادة عدد الإضافات ، لأن عدد المستعمرات التي تم الحصول عليها سيكون أقل. على سبيل المثال ، لوحة 50 ميكرولتر أو أكثر للتركيبات المكونة من أكثر من ثلاث أجزاء.

    اختر المستعمرات وقيّم الحيوانات المستنسخة

    8. اختيار المستعمرات الفردية وتلقيح 5 مل LB وسط. احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في حاضنة شاكر.

    عادةً ما تحتوي نواقل استنساخ Golden Gate على جزء LacZ للفحص الأزرق والأبيض (يتم استخدام أوبرا التخليق الحيوي الكاروتينوي أحيانًا كعلامة للفحص باللونين الأحمر والأبيض). يتم انتقاء المستعمرات البيضاء. بالنسبة لتفاعلات الاستنساخ التي لا تتطلب تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحضير الأجزاء ، يكون انتقاء مستعمرتين كافياً بشكل عام. بالنسبة لتفاعلات الاستنساخ التي يتم إجراؤها من الأجزاء التي تم تضخيمها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قد تكون هناك حاجة إلى أكثر من نسختين للعثور على واحد لا يحتوي على أي طفرات يسببها تفاعل البوليميراز المتسلسل.

    9. تحضير الحمض النووي باستخدام مجموعة miniprep ، التصفية بحجم 50 ميكرولتر.

    10. هضم 1 ميكرولتر في تفاعل 10 ميكرولتر باستخدام إنزيم مناسب (غالبًا بسأنا أو بي بي آيعند استخدام نظام MoClo ، انظر البروتوكول الأساسي 4) لتأكيد التجميع الصحيح عن طريق بصمة الحمض النووي.

    11. إذا تم استخدام تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحضير شظايا الحمض النووي ، فقم بتسلسل البلازميد.

    2: استيعاب متجه لاستنساخ البوابة الذهبية

    يتطلب استنساخ Golden Gate أن تتوافق أجزاء الحمض النووي وناقل المستلم مع متطلبات محددة ، مثل وجود مواقع تقييد إنزيم من النوع IIS في نهايات الشظايا والمتجه ، وعدم وجود مواقع التقييد نفسها في التسلسلات الداخلية للشظايا و المتجه. Many vectors suitable for Golden Gate cloning are available from several research groups, and the number of vectors available will likely grow in the future. Nevertheless, converting a standard cloning vector into a Golden Gate cloning vector is sometimes required for a user's specific needs. There are many strategies to do that, including using Gibson DNA assembly or Golden Gate cloning.

    An example is provided here for converting the pET-28b (+) vector for use with Golden Gate cloning. In this example, a LacZ alpha fragment flanked by two BsaI sites is inserted in the vector, replacing the multicloning site (Fig. 3A). ال LacZ fragment will be used later for blue-white screening. Here, the two fusion sites flanking the LacZ fragment are AATG and GCTT, corresponding to the MoClo standard for cloning of coding sequences (see Basic Protocol 4). However, they can be any other sequences that a user might want, as long as they are different from each other and non-palindromic. Indeed, overhangs consisting of palindromic sequences can anneal to the same overhang of an additional copy of the same fragment in the other orientation, leading to stable ligation products that are nevertheless incorrect and resulting in a significant reduction of the cloning efficiency. In the example provided here, the ATG that is part of the first fusion site corresponds to a methionine start codon, which is cloned in-frame with a His tag present in the upstream vector sequences. The vector and the LacZ fragment are obtained by PCR, and assembly is performed using a second type IIS enzyme, BpiI. Since there are four BpiI sites in the vector, they are removed using primers designed to insert single-nucleotide mutations in the DNA recognition sequences.

    Additional Materials (also see Basic Protocol 1 )

    • Gene-specific primers from commercial vendor (e.g., Eurofins Genomics)
    • Plasmid template for amplification of LacZ cassette (e.g., pUC19, New England Biolabs, cat. no. N3041S)
    • Vector plasmid DNA (e.g., pET-28b (+), Novagen, Merck Millipore, cat. no. 69418)
    • High-fidelity PCR amplification kit (e.g., KOD Hot Start DNA Polymerase, Millipore Sigma, VWR, cat. no. 71086-3)
    • PCR fragment purification kit (e.g., NucleoSpin Gel and PCR Clean-up, Macherey Nagel, cat. no. 740609.250)

    1. Design primers to amplify LacZ fragment.

    Primer locations and sequences for this example are shown in Figure 3. The first two primers, Pr1 and Pr2, are designed to amplify the LacZ fragment from pUC19. pUC19 is selected as a template because it has a different antibiotic resistance gene (Amp R ) from the recipient vector (Kan R ). This reduces the probability of obtaining incorrect constructs by carryover of the undigested template vector when screening clones after transformation. The amplified fragment contains a functional unit for the LacZ marker for blue-white screening. Primers Pr1 and Pr2 have BpiI restriction sites (gaagac in Fig. 3B) with 4-nt fusion sites corresponding to sequences AATG and GCTT, respectively. The fusion sites in the two primers are followed by BsaI restriction sites in opposite orientation (reverse complement of ggtctc = gagacc in Fig. 3B). ال BsaI sites will become part of the resulting vector and will be used for Golden Gate cloning once the vector is made.

    The pET-28b vector contains four BpiI restriction sites in internal sequences, which need to be removed by making single-nucleotide substitutions (a process called domestication). Eight primers are needed for this purpose (Pr3 and Pr6-14). Silent mutations are made for restriction sites located in coding sequences (in this case, the Lac I repressor, which has two BpiI sites). A final pair of primers (Pr4 and Pr5) is made to avoid having to amplify fragments larger than 2 kb this pair of primers is optional. Primers Pr3-14 all have a BpiI site with a fusion site selected to be compatible with the fusion site of the fragment to which it will be ligated.

    When ordering, it is sufficient to get the lowest amount possible (i.e., 0.01 µmol) with minimal purification (salt free).

    1. Set up one 50-μl PCR reaction with primer pair Pr1-2 using pUC19 as a template.
    2. Set up six 50-μl reactions with primers pairs Pr3-4 to Pr13-14 using pET-28b (+) as a template.

    3. Run 5 μl from each reaction on a gel to see if the PCR was successful.

    4. Purify the remaining 45 μl from each reaction using a column-based kit (i.e., Macherey Nagel NucleoSpin DNA Clean-up kit).

    This will separate the PCR product from any remaining DNA polymerase and dNTPs, as well as primer dimers that are produced at various levels in most PCR reactions.

    5. Quantify purified PCR products using a spectrometer such as a Nanodrop.

    6. Perform the Golden Gate cloning reaction (see Basic Protocol 1) using the enzyme BpiI. Transform the product into بكتريا قولونية (see Basic Protocol 1) and select blue colonies.

    In this particular example, transformants should be plated on LB containing kanamycin and X-gal. Correct colonies should not be white, but blue.

    7. Prepare DNA using a miniprep kit.

    8. Digest 1 µl with BsaI in a 10-µl reaction.

    Two fragments of 5.3 kb and 506 bp are expected for this particular construct.

    Sequencing the entire plasmid with primers designed at various positions within the plasmid is desirable because PCR was used for amplification of the entire vector. However, since some regions required for replication or expression of the LacZ marker should be functional if the plasmid replicates and the colonies are blue, the entire plasmid may not need to be sequenced. At a minimum, all elements that will later be required for expression of the gene should be sequenced, including the region extending from the T7 promoter to the terminator. Sequencing of the region containing the two introduced BsaI sites is essential to make sure that the sequence of the two fusion sites is as expected.

    The cloning vector can now be used for Golden Gate cloning.

    3: ACCOMMODATING AN INSERT TO GOLDEN GATE CLONING

    This protocol explains how to design primers to accommodate a sequence of interest to Golden Gate cloning and then clone the amplified fragments in a Golden Gate destination vector. An example is given for cloning the coding sequence of an نبات الأرابيدوبسيس thaliana isoflavone reductase amplified from an أرابيدوبسيس cDNA template (Genbank accession NM_106183).

    Additional Materials (also see Basic Protocols 1 and 2 )

    • cDNA or DNA template for PCR (here, cDNA from أرابيدوبسيس)
    • Plasmid DNA of Golden Gate destination vector

    1. Design silent mutations in the open reading frame of the sequence of interest في السيليكو using cloning software (e.g., Vector NTI).

    In this example, the coding sequence contains one BsaI site (Fig. 4A). It is removed in silico by a single-nucleotide substitution, resulting in a silent mutation (shown in red in Fig. 4B).

    2. Add to the coding sequence two flanking fusion sites for compatibility with the vector.

    In this case, add one A before the start codon to give AATG, and add GCTT after the stop codon.

    The added sequence is shown in red in Figure 4B, and fusion sites are shown in blue.

    3. Select a fusion site at the site of the mutation.

    Two PCR fragments will be amplified, one on each side of the mutation (I and FR in Fig. 4A), and then assembled via a fusion site that overlaps or is near the mutated nucleotide. The fusion site needs to be different from the other fusion sites (AATG and GCTT) and should not be palindromic. It should contain at least one G or C (more, if possible), as sites containing only As or Ts may work less well for DNA assembly (Potapov et al., 2018 ). When many fusion sites are needed, the Ligase Fidelity Viewer program (New England Biolabs, http://ggtools.neb.com/viewset/run.cgi) can be used to check the suitability of all sites. In the present example, a single sequence, GGAC, is selected (shown in yellow in Fig. 4B).

    4. Design primers starting at all fusion sites. Select two primers in opposite orientation for each mutated site (in this case, only one site). Make the primers long enough to give an appropriate melting temperature for PCR amplification.

    5. Add the sequence of the BsaI recognition site (tt ggtctc a) to the beginning of all primers.

    The final list of primers is shown in Figure 4C.

    6. Amplify the two PCR fragments using the appropriate primers pairs (Isof1-2 and Isof3-4 Fig. 4A) from the أرابيدوبسيس cDNA template in a 50-µl reaction. Run 5 µl on a gel to check that the correct fragment was amplified. Purify the remaining 45 µl using a column-based kit according to manufacturer's instructions.

    7. Set up and perform the assembly reaction as described (see Basic Protocol 1).

    Because this example describes a simple cloning with only two fragments cloned into the vector, a simple incubation at 37°C for 2 hr, 50°C for 5 min, and 80°C for 10 min should be sufficient.

    8. Transform the ligation mix into competent بكتريا قولونية, plate on LB containing kanamycin and X-gal, and screen the resulting colonies.

    Minipreps are digested with two enzymes with restriction sites flanking the insert, or with enzymes that have sites in the vector in insert. Because PCR was used for cloning, the cloned insert must be sequenced using primers for sequences in the vector flanking the insert.

    4: GENERATING SMALL STANDARDIZED PARTS COMPATIBLE WITH HIERARCHICAL MODULAR CLONING (MoClo) USING LEVEL 0 VECTORS

    Assembly of DNA fragments from plasmids using Golden Gate cloning can be done quickly and efficiently. In contrast, assembly from PCR products requires more work, because PCR products often contain primer dimers formed by mis-annealing of primers during PCR amplification. Because primer dimers are flanked by the same type IIS restriction sites as the PCR products, they can be cloned, resulting in incorrect constructs and lowering the cloning efficiency (Fig. 5). Even if no primer dimers are made, the cloned constructs need to be sequenced to make sure that they do not contain PCR-induced mutations. Therefore, it makes a lot of sense to have a system where cloned and sequenced DNA parts can be reused in different constructs. For example, parts that contain regulatory sequences such as promoters and terminators can be reused in many different constructs.

    The modular cloning system MoClo was designed to facilitate the reuse of cloned parts in different constructs (Fig. 6). It is based on the use of basic parts that are put together using Golden Gate cloning. The basic parts are cloned as level 0 modules and assembled in level 1 cloning vectors to make transcription units. The level 1 constructs are then assembled to make level M and P multigene constructs. Basic parts contain the coding sequence of a basic genetic element flanked by two BsaI restriction sites in opposite orientation (Fig. 7). Cloning of the basic parts requires amplification from DNA or cDNA as a template. The amplified product is cloned in a recipient vector using Golden Gate cloning. The cloning steps consist of defining the part type, design primers containing BsaI restriction sites at the ends of the fragments, removing sites from internal sequences, and cloning the amplified fragments in a vector.

    Additional Materials (also see Basic Protocols 1 and 2 )

    • cDNA or DNA template for PCR (here, cDNA from أرابيدوبسيس)
    • Universal level 0 cloning vector pAGM9121 (Addgene, plasmid #51833)

    1. Define the type of level 0 module (part).

    Parts can consist of promoters, coding sequences with or without a stop codon, C- or N-terminal fusion tags, and terminators (Fig. 7A). Each part is flanked by two BsaI sites in opposite orientation (Fig. 7B). The 4-bp sequences of the BsaI cleavage sites (fusion sites) are specific for each type of module and define which parts can be fused together. For example, a promoter module with TACT as the 3′ fusion site (Pro in Fig. 7A) can be fused only to an untranslated leader sequence with the same fusion site at the 5′ end (5UTR2 in Fig. 7A). For each part type, a specific cloning vector is available with compatible fusion sites. Alternatively, all part types can be cloned into the universal level 0 cloning vector pAGM9121 (Figs. 7D and 8) as described in this protocol. Level 0 modules may also be composites of several basic parts. For example, constructs containing a complete transcription unit can be cloned directly as level 0 modules between fusion sites GGAG and CGCT. Other types of genetic elements, such as a phage recombination site or a matrix attachment region, can also be cloned as level 0 modules between fusion sites GGAG and CGCT.

    2. Introduce silent mutations in the gene sequence في السيليكو.

    Basic parts should not contain restriction sites for the type IIS enzymes that are used with the MoClo system (Bsaأنا، BpiI, and optionally BsmBI). Restriction sites are removed by introducing single-nucleotide mutations, which is first performed في السيليكو. Removal of internal sites in coding sequences can always be done with a silent mutation. Removal of sequences in promoter regions is more difficult, because sequences important for promoter function are not always known. Therefore, after domesticating promoter sequences, it will be necessary to validate experimentally in the host organism that the promoter still works as intended. Domestication of the أرابيدوبسيس UGT78D2 gene (GenBank accession NM_121711) is presented here as an example. This gene contains one BsaI site, two BpiI sites, and one BsmBI site (Fig. 9A), which are removed by introducing four silent mutations (red in Fig. 10).

    3. Add the two standard fusion sites flanking the part.

    Because this module will be a coding sequence with a stop codon (CDS1), one A is added before the start codon to give AATG, and the sequence GCTT added after the stop codon (both fusion sites are highlighted in blue in Fig. 10).

    4. Add sequences for compatibility with the universal cloning vector.

    In this example, the part will be cloned into the universal level 0 cloning vector pAGM9121. Therefore, CTCA and CGAG are added at the beginning and end of the fragment to provide the necessary compatibility (highlighted in green in Fig. 10). These sequences will become part the BsaI restriction sites that will flank the final level 0 module.

    5. Select the nonstandard fusion sites that will be used for PCR fragment assembly.

    These are the 4-nt sequences that will be used to assemble the PCR products during cloning. They need to be different from each other and from the fusion sites that will be used in the vector (CTCA and CTCG for the universal cloning vector, or AATG and GCTT for the CDS1-specific cloning vector). They also need to be different from the reverse complement of any of the selected fusion sites to avoid inappropriate fragment ligation. The selected sequences are highlighted in yellow in Figure 10.

    6. Design primers starting at all fusion sites, standard and nonstandard.

    For fusion sites at sites mutated to remove restriction sites, primers are designed in both orientations. The primers should be long enough to have an appropriate melting temperature. This can be calculated using any of the many programs available online or can be done manually.

    7. Add the type IIS enzyme recognition sequence.

    لأن BpiI is used for assembly, the sequence tt gaagac aa is added to all primers. Primer sequences and locations are shown in Figure 9.

    8. PCR amplify the fragments.

    Amplify five fragments from أرابيدوبسيس cDNA in separate 50-µl reactions using primer pairs Gtpr1-2 to Gtpr9-10 and a proofreading polymerase. Run 5 µl on a gel to check that each fragment was amplified as expected.

    9. Column purify the fragments.

    The amplified fragments need to be purified to remove remaining polymerase, primers, and dNTPs, and most of the primer dimers that are often present in the reaction. If a single fragment was amplified, using a DNA purification kit (e.g., Macherey Nagel DNA purification kit) is sufficient. Gel extraction of the PCR fragments of the correct size may be necessary if several DNA fragments were amplified.

    10. Set up cloning in the universal level 0 vector pAGM9121 as described (see Basic Protocol 1).

    11. Transform in بكتريا قولونية and pick two white colonies. More colonies can be picked later if sequencing of these clones does not show the correct sequence.

    12. Screen colonies by digesting miniprep DNA with Bsaأنا.

    13. Sequence the clones using the vector primers lev0seqf and lev0seqr (Fig. 9B).

    : GENERATING LARGE STANDARDIZED PARTS COMPATIBLE WITH HIERARCHICAL MODULAR CLONING (MoClo) USING LEVEL –1 VECTORS

    While small parts (<1.2 kb) can be sequenced using standard primers located in flanking vector sequences, large parts cannot be sequenced entirely from vector primers. Additional sequencing primers have to be designed within the part to sequence its middle section. To facilitate sequencing without the need for custom sequencing primers for each part, an alternative strategy consists of cloning part fragments (sub-parts) that are no more than 1-1.2 kb long, sequencing the sub-parts using vector primers, and then assembling the sequenced sub-parts using a second assembly reaction to make the final level 0 module (Fig. 11). Sub-parts are cloned in a universal level –1 cloning vector (pAGM1311, Fig. 12).

    Additional Materials (also see Basic Protocol 4 )

    1. Define the part type, introduce silent mutations, add the standard fusion sites, and add sequences for compatibility with the universal cloning vector as described (see Basic Protocol 4, steps 1-4).

    2. Select the nonstandard fusion sites that will be used for PCR fragment assembly.

    These are the 4-nt sequences that will be used to assemble the PCR products during cloning. They need to be different from each other and from the fusion sites that will be used in the vector (in this case, ACAT and TTGT for the universal level –1 vector see step 5 below). They also need to be different from the reverse complement of any of the selected fusion sites to avoid inappropriate fragment ligation. The selected sequences are the same as those in Basic Protocol 4 (highlighted in yellow in Fig. 10).

    3. Design primers starting at all fusion sites, standard and nonstandard, as described (see Basic Protocol 4, step 6).

    4. Add the type IIS enzyme recognition sequence.

    For cloning in level –1 vectors, BsaI is used for assembly, and thus the sequence tt ggtctc a is added to the 5′ end of all primers.

    5. Add sequences for compatibility with the universal level –1 cloning vector.

    The two fusion sites of the universal cloning vector are ACAT and TTGT, and they contain part of a BpiI restriction site that will flank the sub-part after cloning (Fig. 12). Therefore, the sequences ACAT and ACAA (reverse complement of TTGT) must be added to the two primers that delimit the group of PCR fragments that will be cloned together. These sequences are added immediately 3′ of the BsaI site and before the universal level 0 vector fusion site (CTCA or CTCG). In this example, the first three PCR products will be cloned together in the universal level –1 vector pAGM1311, and the fourth and fifth products will also be cloned together in pAGM1311. Primer sequences and locations for the first level –1 construct (Gtpr1′ to 6′) and second level –1 construct (Gtpr7′ to 10′) are shown in Figure 11.

    6. PCR amplify the fragments (see Basic Protocol 4, step 8) using the appropriate primer pairs (Gtpr1′-2′ to Gtpr9′-10′).

    7. Column purify the fragments (Basic Protocol 4, step 9).

    8. Set up two Golden Gate cloning reactions as described (see Basic Protocol 1) using the universal level –1 vector pAGM1311. Clone the first three products together in one reaction and the fourth and fifth products in the second reaction (level –1 modules in Fig. 11A).

    9. Transform in بكتريا قولونية and pick two white colonies. More colonies can be picked later if sequencing of these clones does not provide the correct sequence.

    10. Screen colonies by digesting miniprep DNA with Bpiأنا.

    11. Sequence clones using the vector primers Levm1seqF and Levm1seqR (Fig. 11B).

    12. Assemble level 0 modules from the level –1 sub-parts. Set up a Golden Gate cloning reaction to assemble the two selected level –1 clones in the universal level 0 cloning vector pAGM9121 (see Basic Protocol 1).

    13. Transform in بكتريا قولونية الخلايا.

    14. Screen colonies by digesting miniprep DNA with Bsaأنا.

    Since PCR was not used to make these constructs, sequencing is not required.

    5: ASSEMBLING TRANSCRIPTION UNITS AND MULTIGENE CONSTRUCTS USING LEVEL 1, M, AND P MoClo VECTORS

    Assembly of multigene constructs using the MoClo system is done hierarchically (Fig. 6). The first step is assembly of level 0 parts in level 1 destination vectors to make constructs that usually contain a transcription unit. The second is assembly of multigene constructs which is done in alternating stages using level M and P vectors. Up to six transcription units can be assembled in a level M cloning vector to make a level M multigene construct. Then, up to six level M constructs can be further assembled into a level P vector to make a level P construct containing up to 36 transcription units. Level P constructs can themselves be further assembled into level M vectors to make even larger constructs. This process can be repeated indefinitely, until constructs become too large to be cloned as plasmids in بكتريا قولونية. Level M and P assembly use Bsaانا و BpiI in an alternating fashion.

    Additional Materials (also see Basic Protocol 1 )

    • Level 0 parts
    • Level 1, M, and P destination vectors from MoClo Toolkit (Addgene, kit #1000000044)

    Assemble transcription units in level 1 vectors

    1. Select standard level 0 parts.

    The first step for planning the assembly of a multigene construct is to identify all basic parts required for each transcription unit. For example, to make a construct containing four transcription units, each composed of three parts—including a promoter with 5′-UTR (pro + 5U), a coding sequence (CDS1), and a 3′-UTR with terminator (3U + Ter)—a total of twelve parts is required.

    A list of all part types is shown in Figure 7. Parts that are not already available are cloned as described (see Basic Protocol 4). Some are already available for plants (MoClo Plant Parts Kit, Addgene, kit #1000000047), كلاميدوموناس (https://www.chlamycollection.org/product/moclo-toolkit/ Crozet et al., 2018 ), and cyanobacteria (http://www.addgene.org/browse/article/28196941/ Vasudevan et al., 2019 ).

    2. Select level 1 destination vectors.

    Fourteen level 1 vectors are available: seven for cloning a transcription unit in the forward orientation in seven different positions in the final construct, and seven for the reverse orientation (Fig. 13A). All contain two BsaI sites and the fusion sites GGAG and CGCT to provide compatibility with level 0 modules. They also contain two BpiI sites for excision of the assembled transcription unit in the next step of assembly. ال BpiI fusion sites are designed to provide compatibility from one vector to the next. In an example where four transcription units are cloned in the forward orientation, vectors for positions 1 to 4 for the forward orientation (pL1F-1, pL1F-2, pL1F-3, and pL1F-4) are selected.

    ال BpiI fusion site at the end of vector 7 (TGCC) is the same as the site at the beginning of vector 1, allowing one to clone more than seven genes in a multigene construct by reusing the same seven vectors indefinitely. Thus, an eighth transcription unit is cloned using vector 1, a ninth transcription unit is cloned using vector 2, and so on (Fig. 13C).

    In the example in Figure 13C, two transcription units are cloned in reverse orientation, and therefore vectors for cloning in the reverse orientation are selected. The choice of whether a transcription unit should be cloned in one orientation or the other is decided solely by the user needs.

    3. Assemble level 1 constructs.

    Constructs are assembled using four Golden Gate cloning reactions, each containing the three selected basic parts and level 1 vector. An example for cloning the first transcription unit is shown in Figure 14. The cloning reaction is performed as described (see Basic Protocol 1). Because level 1 vectors contain a LacZ fragment for blue-white screening, two white colonies are picked. As assembled transcription units are flanked by BpiI sites, miniprep DNA is checked by BpiI digestion.


    Designing primers for PCR based cloning:

    Leader Sequence: Extra base pairs on the 5' end of the primer assist with restriction enzyme digestion (usually 3-6bp)

    Restriction Site: Your chosen restriction site for cloning (usually 6-8bp)

    Do not cut within your insert

    Are in the desired location in your recipient plasmid (usually in the Multiple Cloning Site (MCS)), but do not cut elsewhere on the plasmid

    In our example, we will use EcoRI and NotI to ligate our cDNA into the recipient plasmid. Remember to insert your DNA in the correct orientation in the recipient plasmid by viewing the MCS and fusing the upstream restriction site to the forward primer and the downstream restriction site to the reverse primer.

    Next, we need to examine the DNA sequence that we want to amplify and design primers that will bind to and replicate it. The following image shows the ends of the ORF and how these are used for primer design:

    Because we are cloning an ORF, we want to clone from the start codon (ATG) to the stop codon (TGA, in this example). Assuming you are amplifying from plasmid DNA (rather than from genomic DNA or a cDNA library), roughly 18-21bp is usually sufficient to give specificity and to also be compatible with a standard PCR reaction. Therefore, our Forward Primer will use the sequence 5'-ATGTGGCATATCTCGAAGTAC-3' for the region that binds the ORF and we will add the EcoRI restriction site (GAATTC) to the 5’ end of this primer, making our Forward Primer 5'-GAATTCATGTGGCATATCTCGAAGTAC-3'.

    Many restriction enzymes do not cut DNA efficiently at the end of a linear piece (see NEB for more information). Thus, we recommend that you add 3-6 bases upstream of your restriction site to improve cutting efficiency. You can generally add any 6 bases, but you should ensure that the bases do not result in the formation of a hairpin structure within your primer. In our case, we will add TAAGCA, resulting in a final Forward Primer sequence of 5'-TAAGCAGAATTCATGTGGCATATCTCGAAGTAC-3'.

    For the Reverse Primer, the design is similar, but we need to use the reverse complement to get PCR amplification. We can start similarly, taking the final 18bases of the ORF, including the stop codon (5'-TGGCATATCTCGAAGTACTGA-3'), then adding NotI (GCGGCCGC) and then TAAGCA to improve restriction enzyme digestion. This gives us a sequence of 5'-TGGCATATCTCGAAGTACTGAGCGGCCGCTAAGCA-3' (30bp with 18bp of homology to the ORF). We now need to generate the reverse-complement of this sequence so that we can successfully amplify the ORF. You can generate the reverse-complement using existing software (a quick internet search will lead you to here and many others). If we put the sequence we chose for our reverse primer (5’-TGGCATATCTCGAAGTACTGAGCGGCCGCTAAGCA-3’) into this calculator we get a final Reverse Primer sequence of 5’-TGCTTAGCGGCCGCTCAGTACTTCGAGATATGCCA-3’.


    Introducing Recombinant Molecules into Eukaryotic Hosts

    The use of bacterial hosts for genetic engineering laid the foundation for recombinant DNA technology however, researchers have also had great interest in genetically engineering eukaryotic cells, particularly those of plants and animals. The introduction of recombinant DNA molecules into eukaryotic hosts is called تعداء. Genetically engineered plants, called transgenic plants, are of significant interest for agricultural and pharmaceutical purposes. The first transgenic plant sold commercially was the Flavr Savr delayed-ripening tomato, which came to market in 1994. Genetically engineered livestock have also been successfully produced, resulting, for example, in pigs with increased nutritional value [1] and goats that secrete pharmaceutical products in their milk. [2]

    Electroporation

    Compared to bacterial cells, eukaryotic cells tend to be less amenable as hosts for recombinant DNA molecules. Because eukaryotes are typically neither competent to take up foreign DNA nor able to maintain plasmids, transfection of eukaryotic hosts is far more challenging and requires more intrusive techniques for success. One method used for transfecting cells in cell culture is called التفريد الكهربي. A brief electric pulse induces the formation of transient pores in the phospholipid bilayers of cells through which the gene can be introduced. At the same time, the electric pulse generates a short-lived positive charge on one side of the cell’s interior and a negative charge on the opposite side the charge difference draws negatively charged DNA molecules into the cell (Figure 8).

    Figure 8. Electroporation is one laboratory technique used to introduce DNA into eukaryotic cells.

    Microinjection

    Figure 9. Microinjection is another technique for introducing DNA into eukaryotic cells. A microinjection needle containing recombinant DNA is able to penetrate both the cell membrane and nuclear envelope.

    An alternative method of transfection is called microinjection. Because eukaryotic cells are typically larger than those of prokaryotes, DNA fragments can sometimes be directly injected into the cytoplasm using a glass micropipette, as shown in Figure 9.

    Gene Guns

    Transfecting plant cells can be even more difficult than animal cells because of their thick cell walls. One approach involves treating plant cells with enzymes to remove their cell walls, producing protoplasts. ثم gene gun is used to shoot gold or tungsten particles coated with recombinant DNA molecules into the plant protoplasts at high speeds. Recipient protoplast cells can then recover and be used to generate new transgenic plants (Figure 10).

    Figure 10. Heavy-metal particles coated with recombinant DNA are shot into plant protoplasts using a gene gun. The resulting transformed cells are allowed to recover and can be used to generate recombinant plants. (a) A schematic of a gene gun. (b) A photograph of a gene gun. (credit a, b: modification of work by JA O’Brien, SC Lummis)

    Shuttle Vectors

    Another method of transfecting plants involves ناقلات المكوك, plasmids that can move between bacterial and eukaryotic cells. ال tumor-inducing (Tأنا) plasmids originating from the bacterium أغروباكتريوم توميفاسيانز are commonly used as shuttle vectors for incorporating genes into plants (Figure 11). In nature, the Tأنا plasmids of A. الورم cause plants to develop tumors when they are transferred from bacterial cells to plant cells. Researchers have been able to manipulate these naturally occurring plasmids to remove their tumor-causing genes and insert desirable DNA fragments. The resulting recombinant Tأنا plasmids can be transferred into the plant genome through the natural transfer of Tأنا plasmids from the bacterium to the plant host. Once inside the plant host cell, the gene of interest recombines into the plant cell’s genome.

    Figure 11. Click for a larger image. تأنا plasmid of أغروباكتريوم توميفاسيانز is a useful shuttle vector for the uptake of genes of interest into plant cells. The gene of interest is cloned into the Tأنا plasmid, which is then introduced into plant cells. The gene of interest then recombines into the plant cell’s genome, allowing for the production of transgenic plants.

    Viral Vectors

    Viral vectors can also be used to transfect eukaryotic cells. In fact, this method is often used in العلاج الجيني (see Gene Therapy) to introduce healthy genes into human patients suffering from diseases that result from genetic mutations. Viral genes can be deleted and replaced with the gene to be delivered to the patient [3] the virus then infects the host cell and delivers the foreign DNA into the genome of the targeted cell. Adenoviruses are often used for this purpose because they can be grown to high titer and can infect both nondividing and dividing host cells. However, use of viral vectors for gene therapy can pose some risks for patients, as discussed in Gene Therapy.

    فكر في الأمر

    • What are the methods used to introduce recombinant DNA vectors into animal cells?
    • Compare and contrast shuttle vectors and viral vectors.

    المفاهيم الأساسية والملخص

    • Biotechology is the science of utilizing living systems to benefit humankind. In recent years, the ability to directly alter an organism’s genome through وراثيهندسة has been made possible due to advances in recombinant DNA technology, which allows researchers to create recombinant DNA molecules with new combinations of genetic material.
    • الاستنساخ الجزيئي involves methods used to construct recombinant DNA and facilitate their replication in host organisms. These methods include the use of أنزيمات التقييد (to cut both foreign DNA and plasmid vectors), ربط (to paste fragments of DNA together), and the introduction of recombinant DNA into a host organism (often bacteria).
    • Blue-white screening allows selection of bacterial transformants that contain recombinant plasmids using the phenotype of a الجين المراسل that is disabled by insertion of the DNA fragment.
    • Genomic libraries can be made by cloning genomic fragments from one organism into plasmid vectors or into bacteriophage.
    • cDNA libraries can be generated to represent the mRNA molecules expressed in a cell at a given point.
    • Transfection of eukaryotic hosts can be achieved through various methods using التفريد الكهربي, gene guns, microinjection, ناقلات المكوك، و viral vectors.

    متعدد الخيارات

    Which of the following is required for repairing the phosphodiester backbone of DNA during molecular cloning?

    [reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
    [hidden-answer a=�″]Answer d. DNA ligase is required for repairing the phosphodiester backbone of DNA during molecular cloning.[/hidden-answer]

    All of the following are processes used to introduce DNA molecules into bacterial cells إلا:

    [reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
    [hidden-answer a=�″]Answer c. Transcription is ليس used to introduce DNA molecules into bacterial cells.[/hidden-answer]

    The enzyme that uses RNA as a template to produce a DNA copy is called:

    1. a restriction enzyme
    2. ligase DNA
    3. النسخ العكسي
    4. بوليميريز الحمض النووي

    [reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
    [hidden-answer a=�″]Answer c. The enzyme that uses RNA as a template to produce a DNA copy is called reverse transcriptase.[/hidden-answer]

    In blue-white screening, what do blue colonies represent?

    1. cells that have not taken up the plasmid vector
    2. cells with recombinant plasmids containing a new insert
    3. cells containing empty plasmid vectors
    4. cells with a non-functional لاكز الجين

    [reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
    [hidden-answer a=�″]Answer c. Blue colonies represent cells containing empty plasmid vectors.[/hidden-answer]

    تأنا plasmid is used for introducing genes into:

    [reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
    [hidden-answer a=�″]Answer b. تأنا plasmid is used for introducing genes into plant cells.[/hidden-answer]

    خطأ صحيح

    Recombination is a process not usually observed in nature.

    [reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
    [hidden-answer a=�″]False[/hidden-answer]

    It is generally easier to introduce recombinant DNA into prokaryotic cells than into eukaryotic cells.

    [reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
    [hidden-answer a=�″]True[/hidden-answer]

    املاء الفراغ

    The process of introducing DNA molecules into eukaryotic cells is called ________.

    [reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
    [hidden-answer a=�″]The process of introducing DNA molecules into eukaryotic cells is called تعداء.[/hidden-answer]

    فكر في الأمر

    1. Name three elements incorporated into a plasmid vector for efficient cloning.
    2. When would a scientist want to generate a cDNA library instead of a genomic library?
    3. What is one advantage of generating a genomic library using phages instead of plasmids?
    4. Is biotechnology always associated with genetic engineering? اشرح اجابتك.
    5. Which is more efficient: blunt-end cloning or sticky-end cloning? لماذا ا؟
    1. Liangxue Lai, Jing X. Kang, Rongfeng Li, Jingdong Wang, William T. Witt, Hwan Yul Yong, Yanhong Hao et al. "Generation of Cloned Transgenic Pigs Rich in Omega-3 Fatty Acids." Nature Biotechnology 24 لا. 4 (2006): 435–436. &crarr
    2. Raylene Ramos Moura, Luciana Magalhães Melo, and Vicente José de Figueirêdo Freitas. "Production of Recombinant Proteins in Milk of Transgenic and Non-Transgenic Goats." Brazilian Archives of Biology and Technology 54 لا. 5 (2011): 927–938. &crarr
    3. William S.M. Wold and Karoly Toth. "Adenovirus Vectors for Gene Therapy, Vaccination and Cancer Gene Therapy." Current Gene Therapy 13 لا. 6 (2013): 421. &crarr