معلومة

مجمع كريسبر في الخلايا البشرية؟


هل قسم crispr (حيث يتم حفظ أجزاء DNA الفيروس) من الحمض النووي الموجود في الخلايا البشرية أيضًا أم أنه موجود فقط في خلايا البكتيريا؟


لم يتم العثور على نظائر لنظام CRISPR-Cas في أي نوع من الكائنات حقيقية النواة ، بما في ذلك البشر. حتى الآن ، يبدو أنها تطورت فقط في بدائيات النوى والعتائق.

المرجع: تطور أنظمة الدفاع المضادة للفيروسات الموجهة من الحمض النووي الريبي والحمض النووي في بدائيات النوى وحقيقيات النوى: أصل مشترك مقابل التقارب


يبرمج المهندسون الخلايا البشرية لتخزين التواريخ المعقدة في حمضهم النووي

ابتكر المهندسون البيولوجيون في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا نظامًا لتخزين الذاكرة موضحًا هنا كمقياس مدمج في الحمض النووي يسجل نشاط مسار الإشارات في خلية بشرية. الائتمان: معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا

ابتكر المهندسون البيولوجيون في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا طريقة لتسجيل التواريخ المعقدة في الحمض النووي للخلايا البشرية ، مما يسمح لهم باستعادة "ذكريات" الأحداث الماضية ، مثل الالتهاب ، عن طريق تسلسل الحمض النووي.

يمكن أن يساعد نظام تخزين الذاكرة التناظري - الأول الذي يمكنه تسجيل مدة و / أو شدة الأحداث في الخلايا البشرية - العلماء أيضًا في دراسة كيفية تمايز الخلايا إلى أنسجة مختلفة أثناء التطور الجنيني ، وكيف تعاني الخلايا من الظروف البيئية ، وكيف تخضع للتغييرات الجينية التي تؤدي إلى المرض.

يقول تيموثي لو ، الأستاذ المشارك في الهندسة الكهربائية وعلوم الكمبيوتر والهندسة البيولوجية: "لتمكين فهم أعمق للبيولوجيا ، قمنا بتصميم خلايا بشرية قادرة على الإبلاغ عن تاريخها الخاص بناءً على مسجلات مشفرة جينيًا". ويضيف أن هذه التكنولوجيا يجب أن تقدم رؤى حول كيفية مساهمة تنظيم الجينات والأحداث الأخرى داخل الخلايا في المرض والتطور.

لو ، الذي يرأس مجموعة البيولوجيا التركيبية في مختبر أبحاث الإلكترونيات بمعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا ، هو المؤلف الرئيسي للدراسة الجديدة ، التي تظهر في إصدار 18 أغسطس عبر الإنترنت من علم. المؤلفون الرئيسيون للورقة هم صموئيل بيرلي SM '10 ، دكتوراه '15 وطالبة الدراسات العليا شيريل كوي.

ابتكر العديد من العلماء ، بما في ذلك لو ، طرقًا لتسجيل المعلومات الرقمية في الخلايا الحية. باستخدام إنزيمات تسمى recombinases ، يقومون ببرمجة الخلايا لقلب أجزاء من حمضها النووي عند حدوث حدث معين ، مثل التعرض لمادة كيميائية معينة. ومع ذلك ، تكشف هذه الطريقة فقط ما إذا كان الحدث قد وقع ، وليس مقدار التعرض أو المدة التي استمر فيها.

ابتكر لو وغيره من الباحثين طرقًا لتسجيل هذا النوع من المعلومات التناظرية في البكتيريا ، ولكن حتى الآن ، لم يحققها أحد في الخلايا البشرية.

يعتمد نهج معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا الجديد على نظام تحرير الجينوم المعروف باسم CRISPR ، والذي يتكون من إنزيم قطع الحمض النووي يسمى Cas9 وخيط RNA قصير يوجه الإنزيم إلى منطقة معينة من الجينوم ، ويوجه Cas9 إلى مكان قطعه. .

تُستخدم تقنية كريسبر على نطاق واسع لتحرير الجينات ، لكن فريق معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا قرر تكييفها لتخزين الذاكرة. في البكتيريا ، حيث تطورت تقنية كريسبر في الأصل ، يسجل النظام العدوى الفيروسية السابقة حتى تتمكن الخلايا من التعرف على الفيروسات الغازية ومكافحتها.

يقول بيرلي: "أردنا تكييف نظام كريسبر لتخزين المعلومات في الجينوم البشري".

عند استخدام كريسبر لتعديل الجينات ، يقوم الباحثون بإنشاء خيوط توجيه الحمض النووي الريبي (RNA) التي تتطابق مع التسلسل المستهدف في جينوم الكائن الحي المضيف. لتشفير الذكريات ، اتخذ فريق معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا نهجًا مختلفًا: فقد صمموا خيوطًا إرشادية تتعرف على الحمض النووي الذي يشفر نفس الخيط التوجيهي ، وخلق ما يسمونه "الحمض النووي الريبي التوجيهي الذاتي".

بقيادة حبلا دليل الاستهداف الذاتي RNA ، يقطع Cas9 الحمض النووي الذي يشفر الخيط التوجيهي ، مما يولد طفرة تصبح سجلاً دائمًا للحدث. هذا تسلسل الحمض النووي ، بمجرد تحوره ، يولد خيطًا جديدًا من الحمض النووي الريبي يوجه Cas9 إلى الحمض النووي المتحور حديثًا ، مما يسمح لمزيد من الطفرات بالتراكم طالما أن Cas9 نشط أو يتم التعبير عن دليل الاستهداف الذاتي RNA.

باستخدام أجهزة استشعار لأحداث بيولوجية محددة لتنظيم نشاط Cas9 أو دليل الاستهداف الذاتي RNA ، يتيح هذا النظام حدوث طفرات تقدمية تتراكم كوظيفة لتلك المدخلات البيولوجية ، وبالتالي توفير ذاكرة مشفرة جينومياً.

على سبيل المثال ، صمم الباحثون دائرة جينية تعبر فقط عن Cas9 في وجود جزيء مستهدف ، مثل TNF-alpha ، الذي تنتجه الخلايا المناعية أثناء الالتهاب. عندما يكون TNF- alpha موجودًا ، يقوم Cas9 بقطع الحمض النووي لترميز تسلسل الدليل ، مما يؤدي إلى حدوث طفرات. كلما زاد التعرض لـ TNF-alpha أو زاد تركيز TNF-alpha ، زاد تراكم الطفرات في تسلسل الحمض النووي.

من خلال تسلسل الحمض النووي لاحقًا ، يمكن للباحثين تحديد مقدار التعرض.

يقول بيرلي: "هذا هو السلوك التناظري الثري الذي نبحث عنه ، حيث كلما زادت كمية أو مدة TNF-alpha ، تحصل على زيادات في كمية الطفرات".

"علاوة على ذلك ، أردنا اختبار نظامنا على الحيوانات الحية. يمكن أن تساعد القدرة على تسجيل واستخراج المعلومات من الخلايا الحية في الفئران في الإجابة عن أسئلة بيولوجية ذات مغزى ،" يقول كوي. أظهر الباحثون أن النظام قادر على تسجيل الالتهابات في الفئران.

تؤدي معظم الطفرات إلى حذف جزء من تسلسل الحمض النووي ، لذلك صمم الباحثون خيوط دليل الحمض النووي الريبي الخاصة بهم لتكون أطول من 20 نيوكليوتيدات معتادة ، لذلك لن تصبح أقصر من أن تعمل. تسلسل 40 نيوكليوتيد أطول من اللازم للتسجيل لمدة شهر ، وقد صمم الباحثون أيضًا 70 تسلسلًا من النيوكليوتيدات التي يمكن استخدامها لتسجيل الإشارات البيولوجية لفترة أطول.

تتبع التطور والمرض

أظهر الباحثون أيضًا أنه يمكنهم هندسة الخلايا لاكتشاف وتسجيل أكثر من مدخل واحد ، من خلال إنتاج سلاسل توجيه متعددة من الحمض النووي الريبي ذاتية الاستهداف في نفس الخلية. يرتبط كل دليل RNA بمدخل معين ولا يتم إنتاجه إلا عند وجود هذا الإدخال. في هذه الدراسة ، أظهر الباحثون أنه يمكنهم تسجيل وجود كل من المضاد الحيوي دوكسيسيكلين وجزيء يعرف باسم IPTG.

يقول الباحثون إن هذه الطريقة تُستخدم حاليًا على الأرجح في دراسات الخلايا البشرية أو الأنسجة أو الأعضاء المهندسة. من خلال برمجة الخلايا لتسجيل أحداث متعددة ، يمكن للعلماء استخدام هذا النظام لمراقبة الالتهاب أو العدوى ، أو لمراقبة تطور السرطان. يمكن أن يكون مفيدًا أيضًا في تتبع كيفية تخصص الخلايا في الأنسجة المختلفة أثناء نمو الحيوانات من الأجنة إلى البالغين.

يقول بيرلي: "باستخدام هذه التقنية ، يمكن أن يكون لديك سجلات ذاكرة مختلفة تسجل حالات التعرض لإشارات مختلفة ، ويمكنك أن ترى أن الخلية قد استقبلت كل واحدة من هذه الإشارات خلال هذه المدة الزمنية أو بهذه الكثافة". "بهذه الطريقة يمكنك الاقتراب أكثر من فهم ما يحدث في التنمية."


نظام CRISPR / Cas9

تسمى أحدث التقنيات الرائدة لتحرير الجينوم جمشتهى صعلى سبيل المثال أنامتباعد سهورت صأليندروميك صيعتمد نظام epeat CRISPR / Cas9 على نوكليازات موجهة من الحمض النووي الريبي ، والتي تتمتع بإمكانيات كبيرة نظرًا لبساطتها وكفاءتها وتعدد استخداماتها. النظام الأكثر اعتمادًا هو نظام النوع II CRISPR / Cas9 من الأبراج العقدية (جينك وآخرون ، 2012).

تم وصف وجود هذه التكرارات لأول مرة في Escheria coli في عام 1987 (Ishino et al. ، 1987). تم تحديد تسلسل DNA الفريد الموجود بين التكرارات المسماة الفواصل ولكن لم يتم توضيح وظيفتها حتى عام 2005 عندما تم العثور على التماثل للتسلسل الفيروسي والبلازميد (Bolotin et al. ، 2005 ، Mojica et al. ، 2005 ، Pourcel et al. ، 2005) . اقترح أن هذه الفواصل تم الحصول عليها كآلية دفاع في الميكروبات لغزو العاثيات والبلازميدات. عندما يدخل الحمض النووي الغريب إلى الخلية البكتيرية ، تقطع الإنزيمات المشفرة بواسطة البكتيريا الحمض النووي الغازي إلى أجزاء صغيرة. يتم إدخال واحد أو أكثر من هذه الفواصل الفريدة في الجينوم البكتيري بين تسلسلات التكرار القصيرة داخل صفيف فاصل التكرار في مواضع كريسبر (الشكل 2). ينتقل موضع كريسبر الذي تم تغييره حديثًا إلى الأجيال اللاحقة أثناء انقسام البكتيريا. تسمح هذه "المناعة التكيفية" المزعومة للبكتيريا بالاحتفاظ بذاكرة جينية للفيروسات والبلازميدات التي صادفتها.

الشكل 2. مشغل الجين cas مع تسلسل tracrRNA المنبع ومجموعة فاصل التكرار CRISPR من S. المقيحة.

يحدث نسخ موقع كريسبر عندما تواجه البكتيريا دنا غازيًا ، مما يولد سلائفًا طويلة من الحمض النووي الريبي CRISPR (pre-crRNA). تتم معالجة pre-crRNA إلى crRNAs ناضجة بواسطة إنزيمات المضيف عند انشقاقها في المنبع لكل فاصل ، مما يؤدي إلى توليد العديد من crRNAs الصغيرة من

40 نيوكليوتيدات في الطول. تسلسل صغير من الحمض النووي الريبي المنبع من S. المقيحة تقوم مواضع CRISPR بنسخ الحمض النووي الريبي CRISPR المنشط (tracrRNA ، Barrangou et al. ، 2007) الذي يتحد مع crRNA الناضج لتنشيط وتوجيه نوكلياز Cas9 إلى هدف الحمض النووي المناسب (الشكل 3).

الشكل 3. في نظام النوع الثاني ، تتطلب معالجة pre-crRNA إلى crRNAs الفردية وجود tracrRNA مع التماثل مع التكرار المتناوب (المشار إليه باللون الأحمر). ربط tracrRNA بتسلسل التكرار يجند إنزيمات RNAse III و Cas9 ، والتي تعمل معًا لفصل pre-crRNA إلى crRNAs ناضجة فردية. الشكل مقتبس من https://www.addgene.org/crispr/reference/history/ تم الوصول إليه في 26 أبريل 2016

هناك ثلاثة أنظمة CRISPR-Cas محددة: I و II و III (Markarova et al. ، 2011) ، ولكل منها آليات متميزة لتحقيق المناعة المكتسبة. يتطلب النوعان الأول والثاني من أنظمة CRISPR / Cas9 وجود زخارف مجاورة لـ protospacer (PAMs) ، وهي عبارة عن تسلسلات قصيرة ، 5’-NGG-3 '، أسفل تسلسل 20 نيوكليوتيد crRNA المستهدف لربط نوكلياز Cas9. يحتوي نوكلياز Cas9 على مجالين ، HNH (مجال نوكلياز داخلي مسمى لمخلفات هيستيدين وأسباراجين المميزة) و RuvC (مجال نوكلياز داخلي مسمى لـ بكتريا قولونية بروتين مشارك في إصلاح الحمض النووي) ، وهو المسؤول عن شق كل من خيوط الحمض النووي مع مجال HNH الذي يشق الخيط التكميلي لتسلسل 20nt crRNA. هناك حاجة إلى وجود ثلاثة مكونات لاستهداف الحمض النووي بشكل فعال والانشقاق: 1) كرنا ، 2) تراكرنا و 3) نوكلياز كاس 9 (الشكل 4).

الشكل 4. يتم تجنيد الشكل 4. Cas9 إلى موقع الهدف DNA بواسطة tracrRNA المزدوج: كرنا. يربط crRNA حبلا الحمض النووي التكميلي المنبع من تسلسل PAM. تنشئ مجالات Cas9 HNH و RuvC فاصل DS. الشكل مقتبس من http://dharmacon.gelifesciences.com/gene-editing/crispr-cas9/edit-r-tracrrna/ تم الوصول إليه في 27 أبريل 2016.

أظهر هذا النظام بدائية النواة وظائفه عند إدخاله في الخلايا حقيقية النواة (Cho et al. ، 2013 Cong et al. ، 2013 Hwang et al. ، 2013 Jinek et al. ، 2013 Mali et al. ، 2013). لأغراض تحرير الجينات في الخلايا حقيقية النواة ، تم تبسيط النظام المكون من عنصرين لـ crRNA: tracrRNA المستخدم لتجنيد Cas9 إلى جزيء واحد من الحمض النووي الريبي الوهمي يسمى الدليل الفردي RNA (sgRNA ، Jinek et al. ، 2012). يحتفظ sgRNA بميزتين أساسيتين: تسلسل 20 نيوكليوتيد في الطرف 5 الذي يحدد الموقع المستهدف للحمض النووي عن طريق الاقتران بقاعدة Watson-Crick ، ​​والبنية المزدوجة التي تقطعت بها السبل في الجانب 3 من تسلسل الدليل الذي يرتبط بـ Cas9 ( الشكل 5).

الشكل 5. هيكل Cas9 في معقد مع tracrRNA: ازدواج كرنا بالمقارنة مع جزيء خيمري sgRNA مع حلقة رابط تربط tracrRNA و crRNA. الشكل مأخوذ من https://conditionalknockoutmicemodelservice.wordpress.com/ تم الوصول إليه في 27 أبريل 2016.

يمكّن هذا التعديل من انقسام الحمض النووي المحدد للغاية الذي يستهدف RNA ببساطة عن طريق تغيير تسلسل sgRNA الذي يقلل بشكل كبير من الوقت والتكلفة والصعوبة الفنية لتحرير الجينات.


توصلت الدراسة إلى أن تحرير الجينات Crispr يمكن أن يسبب تغييرات غير مرغوب فيها في الأجنة البشرية

بدلًا من معالجة الطفرات الجينية ، دفعت آلية كريسبر الخلايا إلى فقد كروموسومات كاملة.

يمكن لأداة قوية لتحرير الجينات تسمى Crispr-Cas9 ، والتي حصلت هذا الشهر على جائزة نوبل في الكيمياء لعالمتين ، أن تسبب آثارًا جانبية خطيرة في خلايا الأجنة البشرية ، مما يدفعهم إلى التخلص من أجزاء كبيرة من مادتهم الجينية ، وهو أمر جديد. وجدت الدراسة.

أظهرت دراسة نُشرت في مجلة Cell يوم الخميس ، أن تقنية Crispr-Cas9 ، التي أُعطيت للخلايا لإصلاح طفرة يمكن أن تسبب العمى الوراثي ، تسبب فسادًا جينيًا في حوالي نصف العينات التي فحصها الباحثون.

قال ديتر إيجلي ، عالم الوراثة بجامعة كولومبيا ومؤلف الدراسة ، إن عواقب هذه الأخطاء يمكن أن تكون خطيرة للغاية في بعض الحالات. قال الدكتور إيجلي إن بعض الخلايا كانت مرتبكة للغاية بسبب التعديلات لدرجة أنها تخلت ببساطة عن محاولة إصلاحها ، وتخلصت من الكروموسومات بأكملها ، والوحدات التي يتم فيها حزم الحمض النووي البشري.

قالت نيكول كابلان ، عالمة الوراثة في جامعة نيويورك التي لم تشارك في الدراسة: "غالبًا ما اعتدنا على الاستماع إلى الأوراق البحثية التي تحقق فيها كريسبر نجاحًا كبيرًا". قال الدكتور كابلان: "لكن مع مقدار القوة التي نمتلكها" بهذه الأداة ، من الأهمية بمكان "فهم العواقب التي لم نكن ننويها".

Crispr-Cas9 ، أداة كيميائية تشبه المقص يمكنها قطع أجزاء من المواد الجينية وتخصيصها بدقة ، مثل الحمض النووي البشري ، وأثارت جدلاً دوليًا في عام 2018 عندما استخدم العالم الصيني He Jiankui هذه التقنية لإنتاج أول أطفال معدلين جينيًا في العالم. تم إدانة التجربة على نطاق واسع باعتبارها غير مسؤولة وخطيرة - ويرجع ذلك في جزء كبير منه إلى أن العديد من الطرق التي يمكن أن تؤثر بها تقنية Crispr-Cas9 على الخلايا لا تزال غير مفهومة جيدًا. أدين الدكتور بارتكاب ممارسات طبية غير قانونية في الصين وحُكم عليه بالسجن ثلاث سنوات.

تؤكد النتائج التي توصلت إليها الورقة البحثية الجديدة أيضًا أنه "من السابق لأوانه حقًا تطبيق كريسبر على علم الوراثة الإنجابية" ، كما قالت نيتا فارهاني ، أخصائية أخلاقيات علم الأحياء في جامعة ديوك والتي لم تشارك في الدراسة.

لقد تم بالفعل تقديم علاجات Crispr-Cas9 مباشرة إلى الأشخاص لعلاج حالات مثل العمى - وهو علاج محتمل يؤثر على ذلك المريض وهذا المريض فقط. لكن التعديلات التي يتم إجراؤها على الحيوانات المنوية والبويضات والأجنة يمكن أن تنتقل إلى الأجيال القادمة ، مما يزيد من مخاطر حدوث أي أخطاء على طول الطريق.

على الرغم من أن العلماء كانوا يتلاعبون بالجينوم منذ عقود ، يمكن لـ Crispr-Cas9 إنجاز نوع دقيق من الجراحة الجينية لا تستطيع الأدوات الأخرى القيام به.

يمكن للعلماء استخدام Crispr-Cas9 في منطقة معينة من الجينوم وقصها إلى قسمين. عند استشعار المتاعب ، تندفع الخلية لتضميد جرحها الجيني ، وتستخدم أحيانًا امتدادًا مشابهًا للحمض النووي القريب والسليم كقالب بينما تقوم بربط القطع معًا مرة أخرى. يمنح هذا الباحثين فرصة للربط في قالب مخصص خاص بهم ، على أمل أن تدمج الخلية التغيير المقصود.

في عام 2017 ، أفاد فريق من الباحثين بقيادة شوخرت ميتاليبوف ، عالم الوراثة في جامعة أوريغون للصحة والعلوم في بورتلاند ، أن الأجنة البشرية التي تحمل طفرة يمكن إقناعها في هذه العملية بدون قالب اصطناعي. أنتج الباحثون أجنة من اتحاد بين خليتين: حيوان منوي يحمل طفرة يمكن أن تجعل من الصعب على القلب ضخ الدم ، وبيضة ذات نسخة صحية من الجين. استخدم الدكتور ميتاليبوف وفريقه تقنية Crispr-Cas9 لقطع النسخة المكسورة من الجين لمعرفة ما إذا كانت النسخة السليمة ستوجه إصلاحها. أبلغوا عن نجاح التجربة ونشروها في مجلة Nature.

قال الدكتور إيجلي: "من حيث المبدأ ، يمكن أن تكون هذه طريقة لتصحيح طفرة في جنين بشري" يحتوي على نسخة مكسورة واحدة فقط من الجين.

وأضاف الدكتور إيجلي أن النتائج الجديدة قد تلقي بعض الشكوك حول عمل عام 2017.

ركز الباحثون في دراسة الخلية على طفرة مختلفة - طفرة تسبب العمى الوراثي وتؤثر على جزء مختلف من الجينوم - لكنهم اعتمدوا إعدادًا مشابهًا. باستخدام الحيوانات المنوية المتبرع بها والتي تحتوي على طفرة في جين يسمى EYS ، قاموا بتخصيب البويضات التي تحتوي على نسخ طبيعية من EYS ، ثم أرسلوا Crispr-Cas9 لقص الطفرة.

قال الدكتور Egli إن العديد من الخلايا تمكنت من خياطة قطع Crispr المقطوعة من الحمض النووي مرة أخرى مع بعض التغييرات الطفيفة.

لكن يبدو أن حوالي نصف الأجنة غير قادرة على التعامل مع صدمة الكسر. فشل الضرر الجيني في الشفاء ، مما أجبر الخلايا في النهاية على التمزق وإلقاء قطع كبيرة من الكروموسوم الذي كان يؤوي EYS المتحور. في بعض الخلايا ، فقد الكروموسوم بأكمله.

قال الدكتور إيجلي: "هذا ليس تصحيحًا". "هذه نتيجة مختلفة تمامًا."

قالت ماريا جاسين ، عالمة الوراثة في مركز ميموريال سلون كيترينج للسرطان ومؤلفة أخرى للدراسة ، إنه بدلاً من حث الخلية برفق على تحرير "النص" الجيني الذي تم استهدافها به ، قامت آلية كريسبر بقطع فجوات لا يمكن إصلاحها في الحمض النووي للخلايا. وأضافت أن العواقب السلبية لذلك كانت كارثية بشكل غير متناسب. قال الدكتور جاسين: "كانوا يتحدثون عن محاولة إصلاح جين واحد ، ويتم تغيير جزء كبير من الجينوم".

قال الدكتور إيجلي والدكتور جاسين إن هذا ربما حدث في بحث الدكتور ميتاليبوف لعام 2017 أيضًا ، لكنه ذهب دون أن يلاحظه أحد. بعد أن أجرى فريق الدكتور ميتاليبوف علاجهم Crispr-Cas9 ، لم يعد بإمكانهم اكتشاف الطفرة في الأجنة. لكن الدكتور إيجلي والدكتور جاسين لاحظا أنه ، من الناحية الفنية ، فإن التخلص من جزء كبير من الكروموسوم أو تدميره كان من شأنه أن يمحو دليل الطفرة أيضًا. وقالوا إن ميتاليبوف وفريقه ربما أخطأوا في الحذف على أنه تعديل.

لم يوافق الدكتور ميتاليبوف على هذا التفسير ، وقال إن استنتاجات الورقة الجديدة لم تكن مدعومة بالكامل بالبيانات الضرورية. قال: "ليس لديهم دليل يثبت أن هذه محذوفات". وقال إن التجارب الأكثر تعقيدًا ستكون ضرورية للتمييز بشكل قاطع بين الكروموسوم "المصحح" والكروموسوم الغائب.

قالت الدكتورة كابلان ، من جامعة نيويورك ، إنها وجدت نتائج الورقة الجديدة مقنعة. وقد رددت ، مثل جميع الخبراء الآخرين الذين تحدثوا مع صحيفة نيويورك تايمز ، شعورًا حاسمًا: أن أجنة تحرير Crispr في العيادة يجب أن تظل حقيقة بعيدة ، إذا تمت الموافقة عليها على الإطلاق.

قال الدكتور جاسين: "في هذه المرحلة ، الأمر خطير للغاية". "لسنا متأكدين من الطريقة التي ستسير بها الأمور."

لا تسمح حكومة الولايات المتحدة باستخدام الأموال الفيدرالية لإجراء البحوث على الأجنة البشرية. سعى فريق الدكتور إيجلي للحصول على تمويل خاص من مؤسسة New York Stem Cell Foundation وبرنامج Russell Berrie Foundation في العلاجات الخلوية لإجراء تجاربه.

توجد تقنيات أخرى قائمة على Crispr والتي يمكن أن تتحايل على العديد من المشكلات التي حددها الفريق. على سبيل المثال ، طور بعض الباحثين تقنيات تسمح لهم بإجراء تخفيضات أقل خطورة على الجينوم والتلاعب بحرف وراثي واحد فقط في كل مرة.

وبالنظر إلى النتائج التي توصل إليها فريقه ، طرح الدكتور إيجلي أيضًا فكرة أن النسخة الأكثر حدة من Crispr-Cas9 يمكن يومًا ما نشرها كنوع من القنبلة الجزيئية: تمزيق وإزالة الكروموسومات الزائدة غير المرغوب فيها عند ظهورها في الأجنة.

وحث الدكتور فرحاني من جامعة ديوك على توخي الحذر. وقالت إن الدراسة الجديدة تعتمد فقط على فكرة أن العلماء سيحتاجون إلى المشي ، وليس الجري ، في تطوير أدوات كريسبر للطب الإنجابي.

قال الدكتور فرحاني: "أمامنا طريق طويل لنقطعه". "إلى أن نتمكن من معرفة التأثيرات غير المستهدفة ، وكيف يمكننا التحكم فيها" ، فإن تحرير الأجنة من أي نوع "سيكون أمرًا غير أخلاقي للغاية".


الحثل العضلي الدوشيني

الحثل العضلي الدوشيني هي حالة منهكة تتطور بسبب طفرة في جين واحد ، يسمى جين ديستروفين ، وهو أحد أطول الجينات في الجسم. يعمل فريق من الباحثين في المركز الطبي بجنوب غرب تكساس بقيادة أستاذ البيولوجيا الجزيئية إريك أولسون مع كريسبر لإيجاد طرق لمكافحة الحثل العضلي الدوشيني.

بسبب الطفرة في جين الديستروفين ، لا يصنع الجسم شكلاً وظيفيًا من بروتين ديستروفين ، وهو ضروري لصحة ألياف العضلات. مع مرور الوقت ، يؤدي نقص هذا البروتين إلى تدهور العضلات وضعفها التدريجي.

في أبريل 2017 ، ذكر أولسون وفريقه في مجلة Science Advances أنهم استخدموا نوعًا مختلفًا من أداة CRISPR ، تسمى CRISPR-Cpf1 ، لتصحيح الطفرة التي تسبب ضمور دوشين العضلي. قاموا بتثبيت الجين في الخلايا البشرية التي تنمو في أطباق المختبر وفي الفئران التي تحمل الجين المعيب.

تعد CRISPR-Cpf1 أداة أخرى في صندوق أدوات تحرير الجينات. إنه يختلف عن CRISPR-Cas9 الأكثر شيوعًا في أنه أصغر حجمًا ، مما يسهل توصيله إلى خلايا العضلات ، وفقًا لبيان صادر عن مركز UT Southwestern الطبي. كما أنه يتعرف على تسلسل مختلف للحمض النووي عن Cas9 ، والذي أصبح مفيدًا لتحرير جين الديستروفين الطويل جدًا.


4. الإيدز

هناك عدة طرق يمكن أن تساعدنا بها تقنية كريسبر في مكافحة الإيدز. أحدهما يستخدم كريسبر لقطع الحمض النووي لفيروس نقص المناعة البشرية من مكانه المختبئ في الحمض النووي للخلايا المناعية. يمكن استخدام هذا النهج لمهاجمة الفيروس بشكله الخفي وغير النشط ، وهو ما يجعل من المستحيل على معظم العلاجات التخلص تمامًا من الفيروس.

نهج آخر يمكن أن يجعلنا نقاوم عدوى فيروس نقص المناعة البشرية. يولد بعض الأفراد بمقاومة طبيعية لفيروس نقص المناعة البشرية بفضل طفرة في الجين المعروف باسم CCR5 ، والذي يشفر بروتينًا على سطح الخلايا المناعية التي يستخدمها فيروس نقص المناعة البشرية كنقطة دخول لإصابة الخلايا. تغير الطفرة بنية البروتين بحيث لا يعود الفيروس قادرًا على الارتباط به.

تم استخدام هذا النهج في قضية مثيرة للجدل للغاية في الصين العام الماضي. تم استخدام CRISPR-Cas9 لتحرير الأجنة البشرية لجعلها مقاومة لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية. أثارت التجربة غضب المجتمع العلمي ، حيث أشارت بعض الدراسات إلى أن "أطفال كريسبر" قد يكونون أكثر عرضة لخطر الموت في سن أصغر. يبدو أن الإجماع العام هو أن هناك حاجة إلى مزيد من البحث قبل أن يمكن استخدام هذا النهج في البشر ، خاصة وأن الدراسات الحديثة قد أشارت إلى أن هذه الممارسة يمكن أن تنطوي على مخاطر عالية من التعديلات الجينية غير المقصودة في الأجنة البشرية.


تدخل كريسبر أولى تجاربها السريرية البشرية

غرفة المونتاج سيستخدم العلماء قريبًا المقص الجزيئي CRISPR / Cas9 في جسم الإنسان. سيُحقن محرر الجينات في عيون بعض الأشخاص المصابين بنوع من العمى الوراثي ، حيث يأمل الباحثون أن يقضي على طفرة. تجربتان أخريان هما خلايا تحرير كريسبر خارج الجسم لعلاج السرطان أو اضطرابات الدم.

traffic_analyzer / getty Images plus

شارك هذا:

منذ ظهوره لأول مرة في عام 2012 ، كان تحرير الجينات بتقنية كريسبر واعدًا بعلاج أكثر من 6000 مرض وراثي معروف. الآن يتم اختباره.

في الموجة الأولى من التجارب السريرية ، يستخدم العلماء تقنية كريسبر / كاس 9 لمكافحة السرطان واضطرابات الدم لدى البشر. في هذه الاختبارات ، يزيل الباحثون بعض خلايا الشخص ، ويعدلون الحمض النووي ، ثم يعيدون حقن الخلايا مرة أخرى ، ونأمل الآن أن تكون مسلحة لمكافحة الأمراض.

تم تعيين الباحثين أيضًا لمعرفة كيفية عمل CRISPR / Cas9 داخل جسم الإنسان. في تجربة قادمة ، سيُحقن المقص الجزيئي في عيون الأشخاص المصابين بالعمى الوراثي.

هذه الاختبارات ، إذا نجحت ، يمكن أن تحفز التجارب المستقبلية على الحثل العضلي الدوشيني والتليف الكيسي ومجموعة متنوعة من الأمراض الوراثية الأخرى ، التي تؤثر على ملايين الأشخاص في جميع أنحاء العالم.

اشترك للحصول على أحدث من أخبار العلوم

عناوين وملخصات من أحدث أخبار العلوم من المقالات ، يتم تسليمها إلى بريدك الوارد

تقول لوري زولوث ، أخصائية أخلاقيات علم الأحياء في مدرسة اللاهوت بجامعة شيكاغو: "تقنية كريسبر مثيرة للاهتمام للغاية ، وهي أنيقة جدًا".

لكن تظل هناك أسئلة كبيرة حول ما إذا كان بإمكان تقنية CRISPR / Cas9 أن ترقى إلى مستوى الضجيج.

وقد فشلت التقنيات الواعدة الأخرى في السابق. على سبيل المثال ، ساعد حقن الخلايا الجذعية الفئران المشلولة على المشي مرة أخرى. يقول زولوت إنهم لم يعملوا بشكل جيد مع الناس.

يقول رونالد كونلون ، عالم الوراثة في جامعة كيس ويسترن ريزيرف في كليفلاند ، إن العلاجات الجينية التقليدية ، التي تُدخل نسخًا صحية من الجينات لتحل محل النسخ المسببة للأمراض أو تقاومها ، عانت أيضًا من نكسات شديدة. أصيب بعض الأطفال الذين عولجوا بعيوب المناعة بالسرطان (SN: 1/1/11 ، ص. 24) نجح علاج العمى مؤقتًا ، لكنه لم يوقف تطور المرض (SN عبر الإنترنت: 5/3/15) والأكثر تدميراً هو وفاة المشاركين - بما في ذلك جيسي جيلسنجر البالغة من العمر 18 عامًا في عام 1999 - أثناء مشاركتهم في تجارب العلاج الجيني.

تلوثت سمعة كريسبر العام الماضي بعد أن قام باحث في الصين بتعديل جين في الأجنة تطور ليصبح طفلتين في عام 2018 (SN: 12/22/18 & amp 1/5/19 ، ص. 20). لا تواجه تجارب CRISPR الحالية نفس التحديات الأخلاقية - يتم اختبار العلاجات لدى البالغين والأطفال ، ولن تؤدي إلى تغييرات في الحمض النووي يمكن أن تُورث ، كما يقول ألان ريجينبيرج ، عالم الأخلاقيات الحيوية في معهد جونز هوبكنز بيرمان لأخلاقيات علم الأحياء. ومع ذلك ، كما يقول ، هناك سبب لتوخي الحذر عند العمل مع البشر.

التصفير

CRISPR / Cas9 هو باحث فيروسات معاد تصميمه ، طورته البكتيريا في الأصل. في عامي 2012 و 2013 ، وصف العلماء كيف يمكن تعديل النظام لقطع الحمض النووي في مواقع محددة ، ثم أوضحوا كيف يمكن نشره في الخلايا البشرية والحيوانية. قطعة من الحمض النووي الريبي - جزيء جيني أحادي السلسلة مشابه للحمض النووي - هو جزء كريسبر ويوجه إنزيمًا يسمى Cas9 إلى نقاط معينة في كتاب التعليمات الجينية ، أو الجينوم. شرائح الإنزيم من خلال كلا خيوط الحلزون المزدوج للحمض النووي. يمكن استخدام التخفيضات لتعطيل جينات معينة أو قص الحمض النووي المزعج أو حتى إصلاح مشكلة ما.

لكن CRISPR تنتقل أحيانًا إلى المكان الخطأ ، مما يؤدي إلى تعديلات غير مرغوب فيها أو "تأثيرات خارج الهدف" (SN: 9/3/16 ، ص. 22). حتى مع التخفيضات المقصودة ، يمكن أن تظهر أخطاء غير مرغوب فيها. يقول ريجينبيرج: "نحن لا نفهم دائمًا التغييرات التي نجريها بشكل كامل". "حتى إذا أجرينا التغييرات التي نريد إجراؤها ، فلا يزال هناك تساؤل حول ما إذا كانت ستفعل ما نريد ولا تفعل أشياء لا نريدها."

التجارب البشرية نجح الباحثون في استخدام محرر الجينات CRISPR / Cas9 لتصحيح الأمراض في الحيوانات. الآن بعض الشركات والجامعات تختبر المحرر على الناس. هنا ، يعمل أحد الفنيين في مختبر في Editas Medicine ، وهي إحدى الشركات التي تجري الاختبارات البشرية. إديتاس الطب

ومع ذلك ، فإن تقنية كريسبر أكثر دقة من العلاج الجيني التقليدي ، وبالتالي قد يكون لديها القدرة على علاج بعض الأمراض التي لم يعمل معها العلاج الجيني بشكل جيد ، كما يقول كونلون ، الذي ناقش تحديات تعديل الجينات للتليف الكيسي في يونيو الجينات وأمراض الأمبير. لكن هناك عقبة كبيرة أخرى ، كما يقول ، تتمثل في إدخال تقنية كريسبر في الخلايا حيث تكون هناك حاجة إليها.

التنقيب عن البيانات

يقول كونلون إن التوصيل ليس مشكلة بالنسبة إلى علاجات تعديل الجينات في تجارب علاج السرطان واضطرابات الدم. هذا لأنه ، بالنسبة لتلك التجارب ، لا يتعين على الباحثين وضع CRISPR / Cas9 في الجسم. بدلاً من ذلك ، يأخذون الخلايا الجذعية المكونة للدم من المشاركين ويعدلون تلك الخلايا في أطباق المختبر ، حيث يمكن للعلماء التحقق من وجود مشاكل.

قال متحدث باسم جامعة بنسلفانيا إن باحثين من جامعة بنسلفانيا أعطوا شخصين مصابين بسرطان متكرر علاج كريسبر / كاس 9. شخص واحد لديه عدة ورم نقوي والآخر ، ساركوما. كجزء من تجربة جارية ، تلقى كلاهما الخلايا التائية ، وهي نوع من الخلايا المناعية المبرمجة بتقنية كريسبر لملاحقة الخلايا السرطانية. وتجري محاكمات مماثلة في الصين.

كما تجري تجارب لاثنين من اضطرابات الدم: مرض فقر الدم المنجلي وثلاسيميا بيتا. كلاهما ناتج عن عيوب في جين الهيموجلوبين ، وهو بروتين يحمل الأكسجين في خلايا الدم الحمراء. تم تصميم العلاج لتقليد الإصلاح الذي ابتكرته الطبيعة بالفعل ، كما يقول David Altshuler ، كبير العلماء في Vertex Pharmaceuticals. عادة ، يتوقف إنتاج أحد أشكال الهيموغلوبين الذي يساعد الأجنة في الرحم على انتزاع المزيد من الأكسجين من دم أمهاتهم بعد الولادة. لكن لدى بعض الأشخاص متغير جيني غير ضار يتسبب في إنتاج الهيموغلوبين الجنيني طوال الحياة. يقول ألتشولر: "الأشخاص الذين ورثوا أيضًا طفرة في الخلايا المنجلية أو طفرة بيتا ثلاسيميا لم يكونوا مرضى".

الحل المنجل؟ في مرض الخلايا المنجلية ، تصبح خلايا الدم الحمراء مشوهة (واحدة تظهر مع خلايا الدم الحمراء الطبيعية في هذه الصورة المجهرية الملونة). يمكن أن يساعد تعديل الجينات CRISPR في علاج الاضطراب. مؤسسة الخلايا المنجلية في جورجيا ، جاكي جورج ، بيفرلي سنكلير / مركز السيطرة على الأمراض

يعوض الهيموغلوبين الجنيني عن العيب المسبب للمرض ، وهو شيء تأمل شركة Vertex ، شركة أدوية التليف الكيسي ومقرها في بوسطن ولندن ، في الاستفادة منها لمرضى الخلايا المنجلية. تختبر Vertex و CRISPR Therapeutics ، وهي شركة في كامبريدج ، ماساتشوستس ، ما إذا كانت جروح CRISPR / Cas9 يمكن أن تحاكي المتغير الجيني الذي يحافظ على تشغيل الهيموغلوبين الجنيني مدى الحياة ويخفف الأعراض لدى الأشخاص الذين يعانون من اضطرابات الدم. يقول ألتشولر: "نحن على ثقة تامة من أن التعديلات التي يتم إجراؤها في الخلايا تترجم إلى زيادات واضحة وقابلة للتكرار في الهيموغلوبين الجنيني".

يقول ألتشولر إن الباحثين يتحققون من كل من الجروح والطفرات غير المستهدفة في موقع القطع المرغوب قبل إعادة الخلايا إلى المتطوعين في الدراسة عن طريق زرع نخاع العظم.

أعلنت الشركات في فبراير أنها عالجت شخصًا واحدًا من مرض الثلاسيميا بيتا. قال باحثون في يوليو (تموز) إن شخصًا آخر خضع لنفس النوع من العلاج لمرض فقر الدم المنجلي. لم يعلن العلماء بعد عن نتائج هذه التجارب.

في العين

ومع ذلك ، فإن العديد من الأمراض الوراثية تؤثر على الجسم كله أو الأعضاء التي لا يمكن إزالتها وتعديلها في المختبر. لا أحد يعرف ما إذا كانت تقنية كريسبر تعمل بشكل جيد في جسم الإنسان. لكن تجربة سريرية باستخدام محرر الجينات لعلاج نوع وراثي من العمى يسمى Leber congenital amaurosis 10 قد يساعد في الإجابة على السؤال. يحدث الاضطراب بسبب طفرة في CEP290 الجين الذي يؤدي إلى بروتين غير وظيفي. عندما لا يعمل البروتين ، تموت الخلايا العصوية في شبكية العين ولا تستطيع المستقبلات الضوئية التي تجمع الضوء تجديد نفسها ، مما يؤدي إلى العمى.

ريتينا ريدو تُظهر هذه الصور الجزء الخلفي من عين شخص مصاب بنوع وراثي من العمى يسمى Leber congenital amaurosis 10 ، الناجم عن طفرات في CEP290 الجين. يمكن أن يؤثر المرض على الناس بشكل مختلف. هذا الشخص لديه منطقة رمادية داكنة تغشى المنطقة المركزية من رؤية الشبكية ، تسمى البقعة (يسار). كما أن السطح الداخلي للشبكية يتجعد بمهارة ويتم تمييزه بنقاط (على اليمين). إس. يزر وآخرون/الرؤية الجزيئية 2012

هناك علاج جيني ، تمت الموافقة عليه في عام 2017 من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية ، لنوع من مرض ليبر الخلقي الناجم عن طفرة في RPE65 الجين. لكن CEP290 يقول تشارلز أولبرايت ، كبير العلماء في شركة Editas Medicine ، وهي شركة مقرها في كامبريدج بولاية ماساتشوستس ، تعمل على تطوير تحرير الجينات CRISPR لأمراض وراثية مختلفة ، إن حجمها أكبر من أن يتم وضعه في فيروس للقيام بالعلاج الجيني التقليدي.

في يوليو / تموز ، فتحت شركة Editas وشركة الأدوية العالمية Allergan التوظيف لتجربة تحرير الجينات الخاصة بالعمى. في التجربة ، سيقود اثنان من RNAs الدليل Cas9 إلى إجراء قطعتين من شأنها أن تقطع القطعة المزعجة من الحمض النووي.

تقول أولبرايت إن أول من يحصل على العلاج التجريبي سيكون من البالغين المكفوفين تقريبًا. سيتم حقن كميات صغيرة من محرر كريسبر تحت الشبكية لاختبار الأمان. من غير المؤكد ما إذا كانت الجرعات المنخفضة ستحسن الرؤية. إذا ثبت أن الجرعات آمنة ، سيحصل المتطوعون اللاحقون على جرعات أعلى. يمكن للباحثين أيضًا اختبار العلاج عند الأطفال.

“We’re going into arguably the most difficult patients to start with and we’re going to improve from there,” Albright says.

Editing as few as 10 percent of retinal cells may help restore some sight, he says. In animal tests, CRISPR edited up to about 60 percent of cells in mice and almost 28 percent in monkeys, scientists reported in the February طب الطبيعة.

Sticking with it

Even if these first trials don’t pan out as hoped, CRISPR won’t be shelved, Albright thinks. “This is a technology that’s here to stay,” he says. “If this doesn’t work, it’s going to be more about the underlying biology or our ability to deliver the editing machinery.”

There’s precedence that perseverance — and choosing the right disease to target — can eventually pay off. After setbacks, conventional gene therapy has recently had a big success.

In May, the FDA approved a gene therapy for children with spinal muscular atrophy, a debilitating and deadly genetic disease caused by a mutation that disables the SMN1 الجين. That gene is needed for specialized nerve cells called motor neurons to survive and function properly. Children with the genetic disease often die because the muscles that control breathing fail. The FDA said August 6 that it had been alerted to problems with data manipulation from animal testing of the therapy. But the agency says that the therapy is working well in humans and should stay on the market.

“These kids with SMA who otherwise would have died are up and running and talking and learning and progressing,” Conlon says. “It is just mind-blowing.”

When it comes to gene editing, researchers are banking on similar happy endings. “People are so optimistic and so hopeful again,” Zoloth says. “I want it to work. Everyone who thinks seriously about human suffering should really be wanting this to happen and should be optimistic … about medicine’s capacity and its power.”

Questions or comments on this article? E-mail us at [email protected]

A version of this article appears in the August 31, 2019 issue of أخبار العلوم.


A new CRISPR approach

Prime editing differs from previous genome-editing systems in that it uses RNA to direct the insertion of new DNA sequences in human cells.

The first CRISPR tool harnessed for genome editing in human cells, pioneered at the Broad Institute, MIT, and Harvard, was the Cas9 protein. Cas9 makes nearby breaks on each DNA strand, cutting the DNA entirely. These tools can disrupt target genes at a specific location and then make it possible to add new sequences through recombination of new DNA into the site, directed by the cell itself.

Base editing, first developed by Liu’s laboratory, builds on this technology, fusing Cas9 to proteins that can perform chemical reactions to change a single letter of DNA into another. Current base editors can make four types of single-base changes efficiently: C to T, T to C, A to G, and G to A.

Susanna M. Hamilton/Broad Institute Communications

The new prime editing system involves coupling Cas9 to a different protein called reverse transcriptase. The molecular complex uses one strand of the target DNA site to “prime,” or initiate, the direct writing of edited genetic information into the genome.

A new type of engineered guide RNA, called a pegRNA, directs the prime editor to its target site, where a modified Cas9 cuts one strand of the DNA. The pegRNA also contains additional RNA nucleotides encoding the new edited sequence. To transfer this information, the reverse transcriptase element reads the RNA extension and writes the corresponding DNA nucleotides into the target spot.


CRISPR 101: Applications and Future Potential

Due to its versatility, CRISPR-Cas9 genome editing technologies have the potential to accelerate synthetic biology research and development across a variety of industries. Given that the world’s population is expected to reach close to 10 billion by 2050, such advances are welcome as we look to discover new disease therapies and feed a burgeoning population. CRISPR genome engineering can help medicine to become more personalized for the patient, and will also aid researchers in reacting quickly to emerging epidemics. In a future of shifting climate extremes and migratory populations, the ability to increase yields and engineer adaptations to pests, drought and disease in our food sources will become increasingly important. Furthermore, the ability to quickly bioengineer organisms for biofuel and textile production will help the world address diminishing bioresources.

How can CRISPR-Cas9 genome editing have a positive effect on such a wide range of applications? Read on to find out how it is already having an impact toward a number of research and development activities across many disciplines.

Drug Discovery

CRISPR has exponentially increased how quickly and efficiently the genomes of immortalized cell lines can be engineered. Although other gene editing technologies existed before CRISPR, such as Zinc Finger Nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs), these were typically less efficient, limited by the number of specific locations within a genome that they could target, expensive and time-consuming to generate and utilize. CRISPR, however, requires only two or three components (Cas9 nuclease, guide RNA and optional donor DNA) that are readily available from many sources at practical price points, scales and delivery times. Furthermore, CRISPR can be performed in most existing molecular and cell biology laboratories without the need to invest in expensive new equipment. Using CRISPR, the process of generating gene knockouts, knock-ins and single nucleotide variants (SNVs) in cells in order to model disease has become significantly faster and orders of magnitude more efficient. As more labs, for example, are able to generate cancer genotypes in specific cell lines, more potential targets can be identified and more pharmaceutical drugs evaluated – speeding up the process by which we identify new cures for cancer.

Disease Modeling

Another critical component to studying infectious pathogenesis, autoimmunity, cancer, mechanisms of action of pharmaceutical therapies and drug discovery in general is the ability to generate transgenic animals to model disease. Mice are the most model for many of these applications. Before CRISPR, generating transgenic mice for these applications could be time-consuming and inefficient – sometimes taking up to a year to produce a correct genotype. Much like with cell lines, CRISPR can be used to generate gene knockouts, knock-ins and single nucleotide variants (SNVs) in mouse embryos and this has resulted in a dramatic increase in how fast transgenic mice can be generated. In addition, the increased efficiency at which they are generated results in less overall mice being used in this process.

Personalized Medicine & Gene Therapy

The promise of gene therapy has remained unrealized for some time now. However, with the emergence of CRISPR, the future for such personalized medicines looks bright. While the first published report of an inherited disease mutation corrected in a human embryo (that was allowed to divide to blastomere stage) has generated some early hope for the genetic treatment of rare genetic disorders, less complex gene therapies are currently entering clinical trial phases and could become a reality in the near future. This includes the ability to utilize CRISPR to edit a patient’s own stem cells to repair, for example, a blood disorder such as Sickle Cell Anemia, and then re-implant and expanded number of these edited stem cells back into the patient in order to correct the pathology. Beyond genetic disorders, this process can also be utilized by editing a patient’s stem cells to generate T-cells that are resistant to HIV infection. Another exciting treatment involving T-cells that CRISPR is helping to accelerate is the development of chimeric antigen receptor T-cells, or CAR-T therapies. In this case, a patient’s own T-cells – the orchestrator of many immune responses – are isolated and edited in the laboratory in order to target them towards that patient’s cancer.

Agricultural Biology

Perhaps a more far-reaching application of CRISPR with respect to the world’s growing population, beyond disease therapies, is the generation of transgenic plants. In order to satisfy increasing food demands and to enable farming of crops in areas of the world that were once thought unworkable, advanced genetic breeding techniques will need to be employed. In addition, changing weather patterns could introduce droughts, freezing or new pests into existing agricultural zones. Traditional methods for breeding plants and animals used for food, although time-tested and present in most of the foods we consume today, are very slow – sometimes taking generations to develop, and are not amenable to change. With CRISPR, the time at which it takes to edit plant genomes has increased significantly. While it could previously take several years to generate new varieties of crops, either using traditional breeding or genetics, such diversity generation can now be completed in a matter of months. Already, CRISPR is being used to breed plants that are more resistant to drought, disease and pests.

Biofuels & Specialty Chemicals

Our growing population is also leading to a reduction of non-renewable bioresources, such as coal and crude oil. Compounding this problem are the environmentally destructive nature of many next-generation mining techniques, such as fracking. Synthetic biology is providing solutions for our reliance on petrochemicals and their derivatives by utilizing CRISPR to engineer microbes and plants to generate biofuels and specialty chemicals. These compounds can be used to generate the plastics, textiles, fragrances, lubricants and fuels that millions of people use each day. Engineering microbes and plants to operate as chemical factories in large-scale fermentation processes has traditionally been challenging. With CRISPR, the numerous genetic manipulations required to complete this bioengineering in yeast, bacteria and algae can now be performed at a much faster rate than previously possible. This in turn yields to an accelerated rate at which novel strains can be screened for chemical production and composition before being evaluated at the large-scale fermentation stage. Already, CRISPR is being utilized to engineer bacteria, yeast and algae for the production of hydrocarbons – the precursors for many fuels and specialty biochemicals – and for alternative fuels such as ethanol.

To learn more about the ins and outs of CRISPR-Cas9, download a free copy of Synthego’s eBook here, and follow the five-part CRISPR 101 series here on Synbiology.

About Synthego

Synthego is a leading provider of genome engineering solutions. The company’s product portfolio includes software and synthetic RNA kits designed for CRISPR genome editing and research. With next-generation informatics and machine learning, Synthego’s vision is to bring precision and automation to genome engineering, enabling rapid and cost-effective research with consistent results for every scientist.

Headquartered in Silicon Valley, California, Synthego customers include leading institutions in over 32 countries around the world, 8 of the world’s 10 largest biotechnology companies, and 24 of the top 25 global biology universities.


Scientists Program CRISPR to Fight Viruses in Human Cells

CRISPR is usually thought of as a laboratory tool to edit DNA in order to fix genetic defects or enhance certain traits&mdashbut the mechanism originally evolved in bacteria as a way to fend off viruses called bacteriophages. Now scientists have found a way to adapt this ability to fight viruses in human cells.

In a recent study, Catherine Freije, Cameron Myhrvold and Pardis Sabeti at the Broad Institute of the Massachusetts Institute of Technology and Harvard University, and their colleagues programmed a CRISPR-related enzyme to target three different single-stranded RNA viruses in human embryonic kidney cells (as well as human lung cancer cells and dog kidney cells) grown in vitro and chop them up, rendering them largely unable to infect additional cells. If further experiments show this process works in living animals, it could eventually lead to new antiviral therapies for diseases such as Ebola or Zika in humans.

Viruses come in many forms, including DNA and RNA, double-stranded and single-stranded. About two thirds of the ones that infect humans are RNA viruses, and many have no approved treatment. Existing therapies often use a small molecule that interferes with viral replication&mdashbut this approach does not work for newly emerging viruses or ones that are evolving rapidly.

&ldquoCRISPR&rdquo refers to a series of DNA sequences in bacterial genomes that were left behind from previous bacteriophage infections. When the bacteria encounter these pathogens again, enzymes called CRISPR-associated (Cas) proteins recognize and bind to these sequences in the virus and destroy them. In recent years, researchers (including study co-author Feng Zhang) have reengineered one such enzyme, called Cas9, to cut and paste DNA in human cells. The enzyme binds to a short genetic tag called a guide RNA, which directs the enzyme to a particular part of the genome to make cuts. Previous studies have used Cas9 to prevent replication of double-stranded DNA viruses or of single-stranded RNA viruses that produce DNA in an intermediate step during replication. Only a small fraction of RNA viruses that infect humans produce such DNA intermediates&mdashbut another CRISPR enzyme, called Cas13, can be programmed to cleave single-stranded RNA viruses.

&ldquoThe nice thing about CRISPR systems and systems like Cas13 is that their initial purpose in bacteria was to defend against viral infection of bacteria, and so we sort of wanted to bring Cas13 back to its original function&mdashand apply this to mammalian viruses in mammalian cells,&rdquo says Freije, who is a doctoral student in virology at Harvard. &ldquoBecause CRISPR systems rely on guide RNAs to specifically guide the CRISPR protein to a target, we saw this as a great opportunity to use it as a programmable antiviral.&rdquo

Freije and her colleagues programmed Cas13 to target three different viruses: lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV), influenza A virus (IAV) and vesicular stomatitis virus (VSV). LCMV is an RNA virus that mostly infects mice&mdashbut it is in the same family as the virus that causes Lassa fever, which is found in West Africa and is much more dangerous to study in the lab. IAV is a flu virus although some antiviral medications for flu already exist, such viruses evolve rapidly, so there is a need for better options. Finally, VSV is a model for many other single-stranded RNA viruses.

To determine how effective Cas13 was at destroying the viruses, the researchers also used it as a diagnostic tool to see how much viral RNA was being released from infected cells. They saw a twofold to 44-fold reduction in RNA, depending on which virus they were looking at and the time point. They also looked at how well the released RNA was able to go on and infect new cells. In most cases, they saw a 100-fold reduction in infectivity&mdashand in some cases, more than 300-fold&mdashaccording to Freije. The findings were published online on October 10 in Molecular Cell.

&ldquoThe results are very impressive,&rdquo says Chen Liang, a professor at the Lady Davis Institute at Jewish General Hospital and the department of microbiology and immunology at McGill University in Montreal, who was not involved in the study. His own laboratory has used the Cas9 enzyme to deactivate DNA viruses. The concept is very similar, but Cas13 has a few advantages, he says. For one, Cas13 can be used to target one virus using several guide RNAs, making it difficult for the virus to &ldquoescape.&rdquo Secondly, the new study also used Cas13 to detect how much viral RNA was left over to infect cells. The amount of viral knockdown the group achieved is &ldquovery significant,&rdquo Liang says. &ldquoIf you can target and inactivate all three [of these] viruses, in principle, you can inactivate any virus.&rdquo

As with any approach, there are limitations. One is the question of how to deliver the Cas13 to target a virus in a living person, Liang notes, and the researchers have not yet done any animal studies. Another is the fact that viruses will eventually develop resistance. But Cas13 has an advantage here: when Cas9 cuts viral DNA, mammalian cells repair it and can cause mutations that make the virus more resistant. Yet with Cas13, these cells do not have the mechanism to repair the RNA and introduce errors that would help the virus escape being destroyed. Even if a virus does evolve resistance, or if a new virus is encountered, the method could be quickly adapted.

&ldquoOne of the things that&rsquos most exciting about this approach is the programmability,&rdquo says Myhrvold, a postdoctoral fellow at Harvard. &ldquoOnce you figure out how to do this well for one virus it&rsquos not that hard to design sequences against another virus&mdashor another one. Furthermore, if the virus changes its own sequence&mdashas viruses are known to do, just during an outbreak or in response to therapy&mdashyou can very easily update the CRISPR RNA sequence and keep up with the virus.&rdquo

Freije agrees. &ldquoWe are definitely excited about future prospects of optimizing the system and trying it out in mouse models,&rdquo she says. Beyond therapeutics, the team hopes to understand more about how viruses operate&mdashhow they replicate and what parts of their genomes are most important. Using approaches like this, &ldquoyou can really start to get a better picture of what parts of these viruses are and, most importantly, what really makes them tick.&rdquo


شاهد الفيديو: كيفية عمل تقنية كريسبر للتعديل الوراثي (كانون الثاني 2022).