معلومة

الحد الأدنى لحجم الببتيد / البروتين ليكون مناعيًا في الإنسان؟


ما هو الحد الأدنى لحجم الببتيد / البروتين (المحقون) لإحداث استجابة مناعية في الإنسان؟ المرجع مفيد جدًا أيضًا.

شكرا لك مقدما


هناك عدد قليل من العوامل المحددة بما في ذلك كيفية تقديم البروتينات التي تقيد الحجم الفعلي المطلوب للحصول على عرض الببتيد. هذه تعتمد إلى حد كبير على جزيئات معقد التوافق النسيجي الكبير (HLA في البشر). يحد أخدود الربط في MHC-I فعليًا من حجم الببتيدات التي يمكن تحميلها إلى 8-10 أحماض أمينية ، 9 هي الأكثر شيوعًا. هذا لأن "الجيوب" في أي من طرفي أخدود الربط يقال إنها تستوعب الببتيد بالفعل ، ولا تسمح بتسلسلات أطول بكثير. يفتقر MHC-II إلى هذه الجيوب الممسكة ، وبالتالي يمكنه ربط تسلسلات أطول بكثير (الشكل 1). عادة ما يربط MHC-II تسلسلات من 13-25 من الأحماض الأمينية.

الشكل 1. الفرق بين أخدود الربط MHC-I و II.

يوجد أيضًا عدد معين من بقايا المرساة المطلوبة التي تكمل جيب الربط لأخدود ربط MHC الذي يعرض في الغالب حرفًا معينًا في الموضع المحدد (عادةً ما يكون قطبيًا في موضع معين ، وما إلى ذلك) (الشكل 2).

الشكل 2. مجرد عينة من الاحتمالات عبر الأشكال الإسوية HLA.

جميع المعلومات والأرقام مقدمة من بارهام "The Immune System،" 4th ED.

لو استوفى الببتيد المقدم المتطلبات الأساسية وتم تحديده بواسطة خلية بيضاء ، نظريًا يجب أن ينتج استجابة مناعية. أعتقد أن هذه بعض الاعتبارات الجيدة التي يجب مراعاتها عندما تفكر في مدى صغر حجم الببتيد. أفترض هنا أن MHC-II سيتعامل مع البروتين المحقون من خلال مسار خارج الخلية (لا أستطيع أن أعرف على وجه اليقين) ، وبالتالي فإن أصغر نطاق ببتيد MHC-II رأيته في حياتي هو 11 حمضًا أمينيًا على جانب منخفض. هناك عدد من الدراسات الحسابية التي تحاول التنبؤ بتقارب معقد التوافق النسيجي الكبير ، ولكن هذا يمثل مشكلة نظرًا لنطاق الأحجام التي قد يرتبط بها MHC-II وهناك تباين بين نوى الربط التي تحتوي على الأحماض الأمينية المرساة.


مناعة

ان مناعة هو مستضد أو أي مادة قد تكون مرتبطة بشكل خاص بمكونات الجهاز المناعي (الجسم المضاد ، الخلايا الليمفاوية). نشأ مصطلح المستضد من قدرته على تحفيز توليد الأجسام المضادة. على الرغم من حقيقة أن جميع المستضدات يتم التعرف عليها بواسطة خلايا ليمفاوية معينة أو بواسطة أجسام مضادة ، إلا أنه لا يمكن لكل مستضد إثارة استجابة مناعية. يقال إن تلك المستضدات القادرة على إحداث استجابة مناعية تكون مناعية وتسمى مناعة. [1]

العامل المناعي هو أي مستضد قادر على إحداث استجابة مناعية خلطية و / أو خلوية بدلاً من التحمل المناعي. هذه القدرة تسمى الاستمناع. في بعض الأحيان يتم استخدام مصطلح immunogen بالتبادل مع مصطلح المستضد. ولكن لا يمكن إلا لعامل مناعي أن يثير استجابة مناعية. [2]

بشكل عام ، كلاهما مواد قادرة على إنتاج أجسام مضادة (مستضد) أو تحفيز الاستجابات المناعية (مناعة).

يمكننا تعريف العامل المناعي على أنه مستضد كامل يتكون من الناقل الجزيئي والحلقات (المحددات) التي يمكن أن تحفز الاستجابة المناعية. [3]

من الأمثلة الواضحة على ذلك هو المألوف. Haptens هي مركبات منخفضة الوزن الجزيئي قد تكون مرتبطة بالأجسام المضادة ، ولكن لا يمكنها إثارة استجابة مناعية. وبالتالي ، فإن الهابتينات نفسها ليست مناعية ولا يمكنها إثارة استجابة مناعية حتى ترتبط بجزيء مناعي حامل أكبر. يمكن لمركب الناقل الناشئ ، على عكس المسبب الحر ، أن يعمل كمناعة ويمكن أن يحفز استجابة مناعية. [4]


خلفية

إلى جانب الصرف الصحي ، تعتبر اللقاحات من أكثر أدوات الصحة العامة فعالية واقتصادية لمكافحة الأمراض المعدية [1]. ومع ذلك ، يواجه تطوير اللقاح عددًا من التحديات ، مثل التغلب على الفعالية المحدودة لعدد من اللقاحات ، والحاجة إلى إعادة صياغة اللقاح بشكل متكرر ، فضلاً عن النقص الكامل في اللقاحات لبعض الأمراض. يتمثل الهدف الرئيسي للتلقيح في إنتاج مناعة وقائية طويلة الأمد وواسعة النطاق ضد مسببات الأمراض المستهدفة ، ولكن هذا الهدف يعيقه تنوع كل من مسببات الأمراض المستهدفة وجهاز المناعة البشري [2]. تشمل الحلول العملية الحالية للمشكلة اللقاحات متعددة التكافؤ مثل تلك التي يتم تطويرها لفيروس حمى الضنك [3] أو إعادة صياغة اللقاح الموسمي ضد الأنفلونزا [4].

توفر غالبية اللقاحات التقليدية الحماية من خلال تحييد الأجسام المضادة ونادرًا ما توفر الخلايا التائية الحماية والوقاية من الأمراض. ومع ذلك ، فهي تشارك في الحد من مسببات الأمراض داخل الخلايا ومكافحتها وتطهيرها ، وقد ارتبطت بالمناعة الوقائية ضد عدد من مسببات الأمراض الفيروسية [5-8]. يتمثل أكبر نجاح للمعلومات الحيوية المناعية في تطوير خوارزميات للتنبؤ بألفة ربط الببتيد بمستضد كريات الدم البيضاء البشرية (HLA) - إحدى خطوات الحد من المعدل في الاستجابة المناعية المستندة إلى الخلايا التائية [9]. على الرغم من أن الأشكال الحالية من هذه الخوارزميات عالية الدقة [10-12] ، إلا أن الناتج وحده لا يكفي لإبلاغ اختيار الحلقات للتطبيقات العلاجية. في الإطار المفاهيمي للتلقيح العكسي ، وصف رينو رابولي في السيليكو تنبؤات الحواتم المناعية من بيانات التسلسل البيولوجي "كنهج na & # x000efve" بالمقارنة مع الببتيدات المناعية التوضيحية التجريبية. العديد من المعلمات لهدف لقاح جيد يمنح مناعة فعالة ودائمة ، لا يزال يتعين مراعاتها بعد التنبؤ بربط HLA: خطوات متعددة لتحديد المعدل للمعالجة المسبقة للببتيد ، والتأكيد في الجسم الحي التعبير ، مع الأخذ في الاعتبار ديناميكيات التعبير في المراحل التنموية المختلفة والبيئات الخلوية ، ووجود حاتمة عبر مجموعة مسببات الأمراض ، والاستجابة عبر السكان المضيفين ، واستقرار الحاتمة بمرور الوقت ، وغيرها [13]. هنا ، نعالج مشكلة التباين من خلال تعديل خطوة اختيار المستضد بطريقة حسابية لاختيار أهداف خلايا T متعددة من مناطق بروتينية متجانسة وظيفيًا.

تقليديا ، يتم اختيار أهداف اللقاح من المناطق المحفوظة في جينوم الممرض المعني ، بهدف منح مناعة واسعة ودائمة. تتمثل الخطوة الأولى في تحليل التباين الذي يتم إجراؤه عن طريق حساب تكرار النيوكليوتيدات أو الأحماض الأمينية في كل موضع في محاذاة تسلسل متعدد (MSA) للجينات أو البروتينات المتماثلة [14]. المناطق ، التي تظهر فيها العديد من المخلفات المتتالية درجة عالية من الحفظ (عادةً ما يتم اختيار الحفظ & # x0003e90٪ كحد أدنى) ، ثم يتم تحليلها لاحقًا بحثًا عن الإمكانات المناعية إما عن طريق التنبؤات الحسابية ، أو الاختبار التجريبي ، أو مزيج منهما. يمثل هذا الاستبعاد المنهجي للمتغيرات منخفضة التردد عند استخدام الأساليب التقليدية [15-19] عاملاً مقيدًا رئيسيًا ، نظرًا لأن الإمكانات المناعية لا ترتبط دائمًا بالتكرار في السكان الفيروسي - يمكن أن تكون كل من الببتيدات النادرة والشائعة مولدة للمناعة وذات قيمة في تركيبات اللقاح تهدف إلى تغطية واسعة [20].

نظرًا لأن تطور الجهاز المناعي البشري يحدث على نطاق زمني أطول بكثير من مسببات الأمراض سريعة التحور [21] ، فإن الضغط الانتقائي المرتفع يتسبب في تغيير التعبير عن بعض المستضدات المناعية بشكل أسرع مما يستطيع الجهاز المناعي أن يتطور لمواكبة التغييرات [22]. يُعرف تقارب ارتباط HLA للببتيد بالنسبة إلى تواتره في مجموعة الخلايا الفيروسية أو الخبيثة بكفاءة الاستهداف (TE). لقد ثبت أن TE من الببتيدات يختلف في الكائنات الحية المختلفة ، وفي بعض الفيروسات شديدة التغير تميل إلى أن تكون منخفضة [20]. تشتمل مناطق ارتفاع TE من الببتيدات المحفوظة بشكل كبير ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى الأهمية الوظيفية للبروتين التي تحد من قدرة العامل الممرض على تغيير البروتين مع الحفاظ على لياقته [23]. تشتمل مناطق TE المنخفضة على واحد أو أكثر من الببتيدات ، ومن المحتمل أن تكون جميعها ذات تقارب ارتباط عالي لـ HLA ، ولكن كل منها سيكون لها تردد منخفض في مجتمع مسببات الأمراض. بالنسبة للفيروسات سريعة التحور ، مثل فيروسات الحمض النووي الريبي [24] ، فإن الضغط الانتقائي الذي يمارس على الببتيدات المرتبطة بـ HLA ، يعني أن مناعة المضيف ستستهدف في كثير من الأحيان ، وفي بعض الحالات بشكل تفضيلي ، حواتم منخفضة التردد [20].

اختيار أهداف اللقاح من مناطق البروتين مع ارتباط HLA المحفوظ

نقترح طريقة جديدة ومخطط تصور لتقييم استقرار مناطق البروتين لاكتشاف هدف الخلية التائية ، والذي يأخذ في الاعتبار العلاقة التطورية بين HLA والحلقات الممرضة. وتستند هذه الطريقة على تحليل أعمدة النوافذ المنزلقة ذات الحجم المناسب (من هنا على ما يسمى "الكتل") من صفوف التسلسل في MSA (الشكل & # x200B (الشكل 1). 1). يمكن إجراء MSA لتسلسل البروتين المتماثل باستخدام عدد من الخوارزميات [25] ، وكتل من الببتيدات بحجم معين (عادةً 8-11 حمض أميني طويل لفئة HLA I المقيد و 13-25 حمض أميني طويل لفئة HLA يتم استخراج حواتم الخلايا التائية المقيدة II) من كل موضع في المحاذاة. يشير عدد الببتيدات في كل كتلة إلى تنوع الكتلة ، حيث يمكن حساب إنتروبيا شانون وتكرار الإجماع كمقاييس إعلامية [26].

استخراج الكتل من MSA. تقسيم MSA إلى كتل من الببتيدات ، ل الأحماض الأمينية في الطول. في هذا المثال، ل = 9. يتم تمييز الكتلة 1 باللون الأزرق. إن تحريك النافذة المنزلقة إلى اليمين في MSA بزيادات من موضع واحد سيعطي كل الكتل في MSA.

من أجل تحديد أهداف الخلايا التائية المحتملة ، يتم توقع تقاربات ارتباط HLA لجميع الببتيدات في جميع الكتل. نظرًا لاستخراج الكتل من مناطق متجانسة من البروتينات المتماثلة ، فمن المحتمل أن تعرض الببتيدات داخل كتلة معينة تناظرًا عالي التسلسل وتعرض الغالبية خصائص ارتباط HLA مماثلة حتى عند وجود اختلافات في التسلسل. وبالمثل ، ستكون المناطق المحيطة بالكتلة ذات تماثل عالٍ ، مما يزيد من احتمالية معالجة الببتيدات من نفس الكتلة وتقديمها على سطح الخلايا المستهدفة بطريقة مماثلة [27].

تعتبر كتل الببتيدات أو أكثر والتي يُتوقع أن ترتبط جميعًا بأليلات HLA نفسها مع تقارب مماثل أهدافًا ذات قيمة محتملة لتصميمات اللقاح متعدد التكافؤ. يسمح هذا بالتحصين المتزامن مع عدة حواتم - وهو تكتيك ضروري ضد الفيروسات عالية الطور حيث يمكن أن تحدث الطفرات التي تؤدي إلى مقاومة الأدوية في غضون يوم واحد [28 ، 29]. استخدمنا سابقًا نسخة أولية من تحليل حفظ الكتلة لاكتشاف هدف اللقاح في فيروس حمى الضنك (DENV) [30] وأبلغنا عن عدد أكبر بمقدار 10 أضعاف من المرشحين المستهدفين للقاح CD8 + مقارنةً بدراسة مرجعية سابقة لهدف لقاح DENV المرشحين [31]. نقوم هنا بإضفاء الطابع الرسمي على النهج وتقديم تنفيذ البرنامج. لإثبات فائدة الحفاظ على الكتلة ، أجرينا تحليلًا للحلمات من الفئة HLA من الفئة الأولى في الأنفلونزا A H7N9 hemagglutinin (HA). تم دمج البرنامج في خدمة ويب متاحة مجانًا على http://met-hilab.cbs.dtu.dk/blockcons/.


نتائج

اللقاحات مناعة ووقائية في الفئران الفطرية والفارسية

تم تقييم المناعة والفعالية الوقائية للقاحات المركبة ضد سلالات CovR / S WT و MT في نموذج الفئران لعدوى الجلد Strep A ، في الفئران الفطرية والفارسية. تم إعطاء الفئران ذات السلالة السويسرية (n = 10) J8-CRM + K4S2-CRM / Alum و BALB / c الفئران (n = 10) p * 17-DT + K4S2-DT / Alum ، كثالث حقن عضلي. أعقب التطعيمات النهائية تحديات جلدية مع Strep A CovR / S MT 5448AP (emm 1) أو WT (pNS1 ، emm 100) سلالة. كل من J8-CRM + K4S2-CRM / Alum و p * 17-DT + K4S2-DT / Alum المستحثة ببتيد عيار IgG بين 10 4 –10 6 (البيانات غير معروضة) وكانا فعالين في حماية الفئران (& gt 99٪ تخفيض في الحمل البكتيري) ضد عدوى جهازية يسببها Strep A من سلالة WT أو MT Strep A (الشكل 1 أ-د).

الفعالية الوقائية لـ J8-CRM + K4S2-CRM / Alum ضد الأمراض الغازية التالية لتحدي الجلد. (أ,ب) تم تحصين مجموعات من الفئران السويسرية (ن = 10) عضليًا باستخدام 0.025 مجم / جرعة من J8-CRM + K4S2-CRM / Alum في الأيام 1 و 22 و 43. بعد التعزيز النهائي ، تم تحدي الفئران عن طريق الجلد باستخدام طفرة Strep A 5448AP أو سلالة من النوع البري pNS1. تم إعدام الفئران في اليوم السابع بعد التحدي وتم طلاء عينات الدم لتحديد الحمل البكتيري. (ج,د) الفعالية الوقائية لـ p * 17-DT + K4S2-DT / الشب ضد الأمراض الغازية بعد التحدي الجلدي لفئران BALB / c. تم تحصين الفئران BALB / c (ن = 10 / مجموعة ، أنثى ، 4-6 أسابيع) عن طريق الحقن العضلي بـ 0.025 مجم / جرعة من p * 17-DT + K4S2-DT / الشب في الأيام 0 و 21 و 42. بعد أسبوعين التحصين النهائي ، تم تحدي الفئران عن طريق الجلد باستخدام 5448AP. تم إعدام الفئران في اليوم السابع بعد التحدي وتم طلاء عينات الدم لتحديد الحمل البكتيري (وحدات تكوين المستعمرة [cfu]). العبء الفردي للبكتيريا في الدم (cfu / mL) (أ و ج) ونسبة انخفاض المجموعة في العبء البكتيري في الدم (ب و د) موضحة. يتم تعريف الحماية على أنها نسبة انخفاض في العبء البكتيري وتحسب باستخدام الحمل البكتيري الجيومي في دم المجموعة المحصنة والمجموعة الضابطة (PBS / Alum). تم إجراء المقارنات الإحصائية والرسوم البيانية التي تم إنشاؤها باستخدام اختبار Mann-Whitney باستخدام GraphPad Prism (8.1.2). *** ص & lt 0.001، **** ص & lt 0.0001.

دراسة السمية بجرعة متكررة في جرذان Sprague Dawley من لقاحين مرشحين

تم إعطاء لقاحين مرشحين ، J8-CRM + K4S2-CRM / Alum و p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum ، ومقال تحكم ، CRM / Alum ، للذكور والإناث من فئران Sprague-Dawley (العدد = 20 ، 10 / جنس / مجموعة) في الأيام 1 و 22 و 43. تلقت الفئران 0.5 مل من الحقن العضلي (0.25 مل / فخذ) على النحو التالي: المجموعة 1-0.065 مجم CRM / الشب (مجموعة التحكم) المجموعة 2 - 0.1 مجم J8-CRM + K4S2 -CRM / Alum Group 3–0.1 mg p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum. تحتوي مقالة التحكم ، CRM / Alum ، على 0.065 مجم من CRM وهو متوسط ​​تركيز CRM الموجود في أي لقاح. يحتوي J8-CRM + K4S2-CRM / Alum على 0.05 مجم من J8-CRM و 0.05 مجم من K4S2-CRM لتركيز متقارن ببتيد صافى 0.1 مجم. يحتوي p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum على 0.05 مجم من p * 17-CRM و 0.05 مجم من K4S2-CRM لتركيز متقارن ببتيد صافى 0.1 مجم (الجدول 1). تمت ملاحظة جميع حيوانات الدراسة طوال فترة العلاج حتى تم التخلص من نصف حيوانات الدراسة وتشريحها في يوم الدراسة 57 (الفوج الرئيسي ، بعد أسبوعين من الجرعة 3) تم التخلص من الفئران المتبقية في يوم الدراسة 86 (مجموعة الاسترداد ، 6 أسابيع بعد الجرعة 3).

نجت جميع الحيوانات حتى موعد التضحية. لم يتم الإبلاغ عن أي نتائج سلبية متعلقة باللقاح في العلامات السريرية أو أوزان الجسم أو استهلاك الغذاء أو طب العيون أو علم الأمراض الإجمالي أو الملاحظات العيانية. كانت جميع التغييرات المجهرية التي لوحظت في مجموعات اللقاح ضمن نطاق النتائج المتوقعة بعد التطعيم واعتبرت غير ضارة.

تقييم التهيج المحلي (استنزاف التهديف)

لوحظ وجود احمرار ووذمة طفيفة في جميع مجموعات الجرعات بعد الجرعتين الأولى والثانية. بعد الجرعة الثالثة ، لوحظ تأثير على الحمامي والوذمة في مواقع الحقن في مجموعات اللقاح الأنثوية عند مقارنتها بالإناث في مجموعة التحكم CRM / Alum. النتائج في درجات مجموعات لقاح الذكور مقارنة مع المجموعة الضابطة لم تعتبر ذات صلة من الناحية السمية.

في المجموعة الضابطة للإناث ، حدث ظهور الحمامي بعد 48 ساعة من الجرعة وبدأت في حل 72 ساعة بعد الجرعة. في كلتا مجموعتي اللقاح الأنثوي ، حدثت ذروة ظهور الحمامي في 24 ساعة واستمرت حتى 72 ساعة بعد الجرعة. لوحظت زيادة كبيرة في الحمامي (اليسار واليمين) في 24 و 72 ساعة بعد الجرعة في كل من مجموعتي اللقاح. بالإضافة إلى ذلك ، في 72 ساعة بعد الجرعة ، لوحظت زيادة في درجات وذمة الساق اليمنى واليسرى في المجموعة الأنثوية J8-CRM + K4S2-CRM / Alum ، مقارنة بمجموعة التحكم. لوحظ هذا أيضًا في مجموعة الإناث p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum ، حيث لوحظت زيادة كبيرة في وذمة الساق اليسرى وزيادة (ليست كبيرة) في وذمة الساق اليمنى عند 72 ساعة بعد الجرعة (الشكل 2). ). اعتبرت هذه الملاحظات غير ضارة ولم يلاحظ أي آثار سمية أخرى ذات صلة على التهيج الموضعي.

سجل أنثى درايز بعد الجرعة الثالثة (اليوم 43). يتم التعامل مع درجات Draize على أنها مكررات (ن = 10) ، لكل ملاحظة سريرية ، في نقطة زمنية معينة. جميع الملاحظات السريرية الأربعة (أ) حمامي الساق اليسرى (ب) وذمة الساق اليسرى (ج) حمامي الساق اليمنى و (د) يتم عرض وذمة الساق اليمنى لكل نقطة زمنية. يتم عرض بيانات الملاحظة ، في نقطة زمنية معينة ، على أنها تعني درجة المجموعة مع SD. تم إجراء التحليل الإحصائي والرسوم البيانية التي تم إنشاؤها باستخدام اختبار T لمقارنة كل مجموعة لقاح بمجموعة التحكم CRM / Alum ، في كل نقطة زمنية ، باستخدام GraphPad Prism (8.1.2). * ص & لتر 0.05، ** ص & لتر 0.01.

علم الأمراض السريري

لم يتم الإبلاغ عن أي نتائج سلبية متعلقة باللقاح في الكيمياء السريرية أو التخثر أو تحليل البول طوال مراحل الدراسة. لم يتم اعتبار أي تأثير على معايير أمراض الدم متعلق باللقاح ، خلال مرحلة الجرعات من الدراسة. في التضحية بيوم 86 ، تم الإبلاغ عن زيادة متواضعة في خلايا الدم البيضاء وتعداد الخلايا الليمفاوية في كلتا المجموعتين الأنثويتين اللتين تلقتا اللقاح (فرق كبير 5 ٪ من مجموعة CRM / الشب الضابطة). لوحظ أيضًا ارتفاع معتدل في أعداد الخلايا الوحيدات في اليوم 86 في الإناث اللائي تلقين p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum (فرق كبير بنسبة 5 ٪ من مجموعة التحكم CRM / Alum). لم يتم اعتبار هذه الزيادات ضارة ، بل انعكاس للاستجابة المناعية التي يسببها التحصين.

الاستمناع والتقييم الوظيفي للقاحات في الفئران

لم يتم اكتشاف أجسام مضادة خاصة بالببتيد في عينات الأمصال التي تم جمعها من الفئران قبل الجرعات (الشكل 3 أ ، ب). كانت هناك استجابة مناعية قوية لببتيدات Strep A ، J8 و K4S2 ، في حيوانات المجموعة الرئيسية J8-CRM + K4S2-CRM / Alum (اليوم 57 الأمصال) التي استمرت في مجموعة حيوانات مجموعة التعافي (يوم 86 مصل) (الشكل. 3 أ). بالإضافة إلى ذلك ، كانت هناك استجابة مناعية قوية لببتيدات Strep A ، p * 17 و K4S2 ، في حيوانات المجموعة الرئيسية p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum التي استمرت في حيوانات التعافي (الشكل 3 ب).

مناعة اللقاح ووظيفة الأجسام المضادة التي يسببها اللقاح. (أ,ب) لقاح عيار IgG في مصل الببتيد المحدد في جرذان Sprague-Dawley بعد التطعيم بـ J8-CRM + K4S2-CRM / Alum أو p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum. تم تحصين فئران سبراج داولي عن طريق الحقن العضلي بـ 0.1 مجم / جرعة من J8-CRM + K4S2-CRM / Alum أو p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum في الأيام 0 و 21 و 42. تم قتل الفئران بطريقة القتل الرحيم في اليوم 57 واليوم 86. J8 ، p * 17 و K4S2 مصل IgG التتر (Geomean) معروضة للفئران الفردية التي تم تلقيحها بـ J8-CRM + K4S2-CRM / Alum (أ) أو p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum (ب) الموت الرحيم في اليوم 57 (ن = 10 5 ذكور ، 5 إناث) أو 86 (ن = 10 5 ذكور ، 5 إناث). يتم أيضًا عرض التتر IgG في المصل (اليوم 0) للتلقيح المسبق لنفس الفئران التي تم تقييمها في اليوم 57 أو -87. تم اعتبار العينات موجبة عندما كانت القيمة المتوسطة للامتصاص ، لأعلى تخفيف (1: 100) ، أعلى من OD المتوسط ​​للسيطرة السلبية. (ج,د) بكتيريا Strep: ارتباط سطحي بالأجسام المضادة التي يسببها اللقاح. الأمصال التي تم جمعها من الفئران التي تم تلقيحها باستخدام J8-CRM + K4S2-CRM / Alum ، p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum أو CRM / Alum في دراسة السموم تم تقييمها من أجل الارتباط المباشر لـ IgG بقتل الحرارة pM1 (ج) و 5448AP (د). يتم عرض متوسط ​​التتر الفردي من الأمصال التي تم جمعها من الأيام 0 (ن = 4) و -57 (ن = 4) والمعايرة بواسطة ELISA. تم إجراء التحليل الإحصائي والرسوم البيانية التي تم إنشاؤها باستخدام اختبار Mann-Whitney لمقارنة جميع المجموعات ، باستخدام GraphPad Prism (8.1.2) *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ، ***ص & lt 0.001 ، ****ص & lt 0.0001.

تم تقييم وظيفة الأجسام المضادة التي يسببها اللقاح في الفئران عن طريق التعرف على البروتينات البكتيرية من الأجسام المضادة. تم تقييم الأجسام المضادة التي يسببها اللقاح المتولدة في دراسة السموم من أجل التعرف المباشر على بروتينات البكتيريا بواسطة ELISA. جمعت سيرا الجرعات المسبقة (اليوم 0) وفي التشريح الرئيسي (اليوم 57) ، من كل مجموعة J8-CRM + K4S2-CRM / Alum ، p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum و CRM / Alum (n = 4 / مجموعة) ، إلى الآبار المطلية بالحرارة المقتولة ، ومستحضرات الخلية الكاملة من Strep A emm 1 سلالات pM1 (WT) و 5448AP (MT). تم تحديد الارتباط المباشر لبروتينات البكتيريا من خلال التتر الكلي IgG. بشكل عام ، لوحظ ارتباط كبير ببروتينات البكتيريا في اليوم 57 عيارًا لجميع الأفواج مقارنة باليوم 0 عيار. تم أيضًا إجراء تحليل مقارن بين ارتباط الأجسام المضادة التي يسببها اللقاح المرشحة والأجسام المضادة التي يسببها CRM / Alum. لم يلاحظ أي فرق كبير في قدرة الارتباط لليوم 57 J8-CRM + K4S2-CRM / Alum و p * 17-CRM + K4S2-CRM / الأجسام المضادة التي يسببها الشب للنوع البري أو البكتيريا الطافرة. كان الارتباط بـ WT pM1 إما عن طريق J8-CRM + K4S2-CRM / Alum أو p * 17-CRM + K4S2-CRM / الأجسام المضادة التي يسببها لقاح الشب أعلى بكثير (ص & lt 0.05) من الأجسام المضادة التي يسببها CRM / Alum. كان الارتباط بـ MT 5448AP بواسطة p * 17-CRM + K4S2-CRM / الأجسام المضادة التي يسببها لقاح الشب أعلى بكثير (ص & lt 0.05) من الأجسام المضادة التي يسببها CRM / Alum. لم يكن هناك فرق كبير في الارتباط بـ 5448AP بين اليوم 57 J8-CRM + K4S2-CRM / Alum و CRM / Alum. أخيرًا ، لم يلاحظ أي اختلاف كبير في الارتباط بين عيار اليوم 0 لجميع الأفواج (الشكل 3 ج ، د).

أوزان الأعضاء

لم يتم الإبلاغ عن أي تغييرات في الوزن مرتبطة باللقاح في الدماغ أو البربخ أو القلب أو الكلى أو الكبد أو الرئتين في يوم 57 أو -86 تشريحًا. لوحظت زيادة طفيفة أو طفيفة في أوزان الغدة الكظرية في ذكور الجرذان التي تتلقى اللقاح المرشَّح ، مقارنةً بالتحكم في CRM / Alum ، في التضحية في اليوم 57. كان هذا يعتبر تغييرًا شائعًا في علم الأمراض السمية. كان الارتباط النسيجي المرضي هو تضخم قشر الكظر ، والذي عادة ما يكون ثانويًا للإجهاد الفسيولوجي. لم يتم الإبلاغ عن أي تغييرات في وزن الأعضاء المرتبطة باللقاح في التضحية بيوم 86.

تحليل الأنسجة

يتم توفير قائمة بالأعضاء والأنسجة المحتجزة للفحص التشريحي المرضي في الجدول التكميلي S1. باختصار ، كانت الملاحظات المجهرية في الفئران التي تلقت اللقاح ، عند مقارنتها بفئران التحكم CRM / Alum ، عبارة عن التهاب حبيبي في مواقع الحقن اليمنى و / أو اليسرى والغدد الليمفاوية الأربية في الذكور و / أو الإناث ، وتضخم قشر الكظر عند الذكور . اعتبرت جميع الملاحظات غير سلبية.

في تضحية اليوم 57 ، كان معدل الإصابة بالالتهاب الحبيبي الذي لوحظ في مواقع الحقن اليمنى واليسرى مشابهًا بين مجموعة التحكم ومجموعات اللقاح (الجدول التكميلي S2). كانت هناك زيادة طفيفة في شدة الالتهاب الحبيبي في كل من مواقع الحقن اليمنى واليسرى لذكور الجرذان وموقع الحقن الأيمن لإناث الفئران التي تلقت J8-CRM + K4S2-CRM / Alum. وبالمثل ، كانت هناك زيادة طفيفة في شدة الالتهاب الحبيبي في مواقع الحقن اليمنى واليسرى لإناث الجرذان وموقع الحقن الأيسر للذكور الجرذان التي تلقت p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum. في اليوم 86 ، استمرت زيادة طفيفة في شدة الالتهاب الحبيبي في موقع الحقن الصحيح لواحدة من الفئران الإناث الخمس التي تلقت p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum. لم يلاحظ أي دليل على استمرار التهاب الورم الحبيبي في موقع الحقن الأيسر. احتوت الورم الحبيبي في موقع الحقن على مجاميع من الضامة تتخللها أعداد صغيرة من الخلايا الليمفاوية وخلايا البلازما عادة حول محيط تجمعات البلاعم.

لوحظت زيادة في شدة الالتهاب الحبيبي في مجموعات اللقاح في الغدد الليمفاوية الأربية (الجدول التكميلي S3). في تضحية اليوم 57 ، عانت المجموعة التي تدار من J8-CRM + K4S2-CRM / Alum زيادة طفيفة في شدة التهاب الورم الحبيبي في العقد اليمنى واليسرى من إناث الجرذان والعقد اليمنى من ذكور الجرذان. تم اعتبار معدل الإصابة الكلي لهذه النتيجة متشابهًا عبر مجموعات التحكم واللقاح. بالإضافة إلى ذلك ، في ذبيحة اليوم 86 ، لوحظت زيادة طفيفة في الشدة في العقد الليمفاوية الأربية اليسرى لإناث الجرذان في مجموعتي اللقاح. لم يلاحظ زيادة الالتهاب الحبيبي في العقد الإربية اليسرى لذكور الجرذان أو العقد الإربية اليمنى لأي من الحيوانات. كما هو الحال مع الالتهاب الحبيبي في موقع الحقن ، تميزت الأورام الحبيبية في الغدد الليمفاوية الأربية بوجود تكتلات من الضامة. كانت المادة السيتوبلازمية للبلاعم الفردية توحي بوجود مادة مساعدة ملوثة.

في تضحية اليوم 57 ، تم الإبلاغ عن تضخم بسيط أو معتدل في قشر الكظر في ذكور الجرذان في مجموعتي اللقاح ، مقارنة بمجموعة التحكم CRM / Alum (الجدول التكميلي S4). لم يُلاحظ حدوث تضخم معتدل أو ملحوظ في أي حيوان. تم وصف السيتوبلازم للخلايا الظهارية القشرية على أنها حمضية متجانس ، بينما أدت الزيادة في حجم الخلية إلى ضغط الأوعية الدموية القريبة. كان تضخم قشرة الكظر هو الارتباط التشريحي المرضي لزيادة أوزان الغدة الكظرية ، وهي استجابة إجهاد نموذجية لوحظت في دراسات السمية 20. في سياق هذه الدراسة ، اعتبرت الملاحظة ثانوية للإجهاد الفسيولوجي وليست مرتبطة باللقاح. لم يكن هناك تقرير عن تضخم قشر الكظر في التضحية بيوم 86.

فحص الكلى والدماغ والمفاصل

لم يتم الإبلاغ عن أي نتائج سلبية متعلقة باللقاح في الكلى. في كل من عمليات التشريح في اليوم 57 و -86 ، لم يكن هناك دليل على حدوث ضرر عياني (آفات) أو تغيرات في وزن العضو. لم يكن هناك أي تأثير على معايير تحليل البول ، بما في ذلك الدم والبروتين ، بعد إعطاء أي من اللقاحين مقارنةً بالتحكم في CRM / Alum.

تم الإبلاغ عن مجموعة واسعة من النتائج النسيجية المرضية في الكلى في كل من اليوم 57 و -86 من التشريح وتم تحديدها في الجدول 2. كانت هذه النتائج من حدوث وشدة مماثلة في مجموعة التحكم CRM / الشب والمجموعات المعالجة باللقاح. تم اعتبار الملاحظات عرضية بالنسبة لسلالة الفئران وعمرها وليست متعلقة باللقاح.

لم يكشف فحص أدمغة جميع الحيوانات عن أي دليل على حدوث ضرر عياني (آفات) أو نتائج مرضية في الأنسجة في اليوم السابع والخمسين من التشريح ولا يوجد دليل على حدوث تغيير في وزن العضو في اليوم 57 أو 86. في اليوم 86 ، ذكر فأر وحيد وجد أن p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum لديها تمدد خفيف في البطين. لم يتم الإبلاغ عن أي نتائج نسيجية أخرى متعلقة بالدماغ لليوم 86.

كما لم يتم الإبلاغ عن أي التهاب في مفاصل أي حيوان يتلقى اللقاح.

فحص القلب

لم يجد الفحص المجهري للقلب أي دليل على التهاب الصمامات ، ومع ذلك ، لوحظ الحد الأدنى من اعتلال عضلة القلب في 11 من 60 حيوانًا واعتلال عضلة القلب الخفيف في حيوان واحد ولم يُلاحظ حدوث اعتلال عضلي معتدل أو ملحوظ في أي حيوان (الجدول 3). التحليل الإحصائي (اختبار فيشر الدقيق ، ص & lt 0.05 ، GraphPad Prism) لاعتلال عضلة القلب الذي لوحظ في اليوم 56 في المجموعات التي تلقت اللقاح مقارنة بمقال التحكم لم تحدد أي فرق كبير في المعدلات الملاحظة (J8-CRM + K4S2-CRM / Alum ص القيمة 0.9999 ، p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum ص القيمة 0.9999). بالإضافة إلى ذلك ، حددت الملاحظات في اليوم 86 في المجموعات التي تلقت اللقاح مقارنة بمقالة التحكم عدم وجود فرق كبير في معدلات اعتلال عضلة القلب الملحوظة (J8-CRM + K4S2-CRM / Alum ص القيمة 0.0867، p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum ص القيمة 0.2105). تتماشى ملاحظة اعتلال عضلة القلب مع دراسات علم السموم الأخرى ، حيث يُعد اعتلال عضلة القلب التلقائي في فئران سبراغ داولي نتيجة شائعة في الخلفية وقد تم الإبلاغ عن حدوث ما يصل إلى 100 ٪ ، خاصة عند الذكور 21. كان الاستنتاج العام أنه نتيجة عرضية لا علاقة لها باللقاحات. هذا يدعم النتائج السابقة التي توصلنا إليها مع J8 في نموذج التهاب صمام القلب 13.

استقرار اللقاحات على مدى 12 شهرًا

تم تقييم استقرار اللقاحات ، للتخزين طويل الأجل عند 5 درجات مئوية ± 3 درجات مئوية ، عند 3 و 6 و 12 شهرًا (T3 ، T6 ، T12) ، بعد التصنيع (الوقت 0). كانت معلمات الاستقرار التي تم تقييمها هي المظهر ، ودرجة الحموضة ، والامتصاص إلى الشب (الجدول 4) والاستمناع (الشكل 4). ثبت أن اللقاحات مستقرة لمدة تصل إلى 12 شهرًا ، عند تخزينها عند 5 درجات مئوية ± 3 درجات مئوية ، مع عدم ملاحظة أي تغييرات كبيرة على أي معلمات تم قياسها خلال تلك الفترة. وشمل ذلك إحداث استجابة مناعية قوية متوقعة في جرذان Sprague Dawley.

استقرار اللقاحات. تمت مقارنة عيار IgG في مصل الببتيد المحدد في جرذان Sprague-Dawley ، بعد التطعيم بـ J8-CRM + K4S2-CRM / Alum أو p * 17-CRM + K4S2-CRM / الشب المخزن لمدة 0 و 3 و 6 و 12 شهرًا. تم تحصين فئران سبراج داولي مرة واحدة في العضل بـ 0.1 مجم / جرعة من J8-CRM + K4S2-CRM / Alum أو p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum. 18 ± 2 يومًا بعد التحصين ، نزفت الفئران. يتم عرض J8 و p * 17 و K4S2 المصل IgG التتر. عيار IgG في الجرذان (ن = 6 3 ذكور ، 3 إناث) تم تطعيمهم بـ J8-CRM + K4S2-CRM / الشب (أ) أو p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum (ب) مخزنة لمدة 0 (T0) و 3 (T3) و 6 (T6) و 12 شهرًا (T12). تم اعتبار العينات موجبة عندما كانت القيمة المتوسطة للامتصاص ، لأعلى تخفيف (1: 100) أعلى من OD المتوسط ​​لعنصر التحكم السلبي. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار Mann-Whitney لمقارنة جميع المجموعات بمجموعة T0 ، باستخدام GraphPad Prism (8.1.2). *ص & lt 0.05.


نتائج ومناقشة

تصميم CHOPS

ال المكورات العنقودية بروتين CHIPS هو أحد أكثر مثبطات الاستجابات الالتهابية التي يسببها C5a فعالية والمعروفة حاليًا. على عكس العوامل العديدة التي تم تطويرها للتفاعل مباشرة مع موقع تنشيط C5aR الموجود داخل قلب المستقبل (Proctor et al. - الجزء النهائي من C5aR (Postma et al. 2005). سطح تفاعل رقائق31–121 مع C5aR يتألف

20٪ من سطحه المذيب الذي يسهل الوصول إليه ولا يقتصر على منطقة محدودة من البروتين. تتضمن التفاعلات بين CHIPS و C5aR عددًا كبيرًا من الأحماض الأمينية غير المتسلسلة الموضوعة على النحو الأمثل في البروتين المثبط لتوفير ارتباط محكم. يجب ألا يشتمل التقليد الناجح لـ CHIPS على بقايا الأحماض الأمينية (أو تقليدها) المهمة لربط C5aR فحسب ، بل يجب أيضًا تضمين الأحماض الأمينية المسؤولة عن الترتيب المكاني المناسب الذي تمليه طوبولوجيا CHIPS القابلة للطي. نهجنا الأول لبناء مثل هذا الهيكل هو استبعاد عدد محدود من المخلفات التي لا تتفاعل بشكل مباشر مع C5aR ، ولكن بهدف ترك السلامة الهيكلية لـ CHIPS31–121 متصل. كشفت دراسات معايرة الرنين المغناطيسي النووي أن منطقتين من رقائق31–121 تظهر اضطرابات كبيرة نسبيًا في تحولات العمود الفقري والتحولات الكيميائية C (Ippel et al. 2009): المنطقة الأولى تشمل المخلفات 43-61 ، والتي تشتمل على جزء من α-helix والحلقة اللاحقة التي تربط حبلا β1 (الشكل 1 أ). المنطقة الثانية تتكون من مخلفات 95-111 وتتكون من جدائل β3 و β4 من رقائق31–121. الجزء غير المتفاعل من رقائق البطاطس31–121 يتألف من حبلا β2 والحلقة الطويلة التي تربط2 مع β3 (الشكل 1 أ). يمكن ترك هذا الجزء خارجًا عن طريق توصيل الخيط مباشرة β1 مع β3 عبر منعطف ضيق. فحص النماذج الهيكلية للرنين المغناطيسي النووي من رقائق31–121 يكشف أن البقايا L65 في نهاية حبلا β1 وبقايا K95 في بداية الخصلة β3 are proximal and offer an excellent opportunity to link the two fragments interacting with the C5aR together to form one short, contiguous sequence. Several β-hairpin inducing sequences have been described and reviewed in the literature (Blanco et al. 1998 Stotz and Topp 2004). One of the smallest peptide fragments, which induces a β-turn and facilitates the formation of an anti-parallel β-sheet, is the dipeptide D-Pro-Gly (Haque and Gellman 1997). This fragment was chosen to link the N- and C-terminal segments of CHIPS, which interact with the C5aR, together. These segments were chosen to comprise the complete elements of secondary structure as present in native CHIPS (i.e. the α-helix and β-strands β1, β3, and β4) in order to pursue structural integrity. The resulting construct consisted of the CHIPS amino acid sequences T36-L65 and K95-G112 interconnected by D-Pro-Gly (Fig. 1b). A number of residues suggested to be part of discontinuous immunogenic epitopes by Gustafsson et al. (2009) are not present in this construct (designated CHOPS). A model representation of CHOPS based on the structure of native CHIPS31–121 is presented in Fig. 1c.

Affinity of CHOPS for the C5aR N terminus

The affinity of the CHOPS fragment for the C5aR was determined using isothermal titration calorimetry (ITC). We synthesized two peptide mimics of the C5aR N terminus: unsulfated peptide C5aR7–28 representing residues 728 of the C5aR and peptide C5aR7–28س2, the same sequence with tyrosine residues 11 و 14 ا-sulfated. We titrated a solution of CHOPS with these peptides and recorded the subsequent heat exchange upon formation of the complex. Two typical ITC experiments are shown in Supplementary Figure 3. Clearly, titration of the doubly sulfated peptide C5aR7–28س2 to CHOPS resulted in a substantial exothermic effect (Supplementary Figure 3a) while no significant response was detected in the ITC experiment with the unsulfated peptide C5aR7–28 (Supplementary Figure 3b). Gratifyingly, the affinity of CHOPS for C5aR7–28س2 was in the micromolar range (ك د = 3.6 ± 0.2 μM ن = 3). The complete thermodynamic analysis of these ITC data plus the comparison with previous ITC studies of CHIPS31–121 and C5a peptide mimics is compiled in Supplementary Table 1.

NMR spectroscopy

Previous NMR studies revealed that the synthetic peptides C5aR7–28 and C5aR7–28س2, which mimic the N-terminal portion of the C5aR, were very flexible in solution and did not have detectable propensity for any preferred secondary structure. Although there is no detailed structure available for the intact C5aR, it is expected that its free extra-cellular N terminus (residues 1–35) is unstructured as well. The protein CHIPS31–121 does adopt a well-defined conformation with flexible regions at the termini and some disorder in the loop region between the α-helix and strand β1 (Haas et al. 2005). As could be inferred from 15 N relaxation studies this particular loop region adopts an ordered conformation in the complex with C5aR7–28س2 (Ippel et al. 2009). NMR spectra of the free CHOPS construct appear to be typical for a largely unstructured polypeptide chain (Supplementary Figure 4a). 2D NOE spectra of free CHOPS contain predominantly sequential NOEs, but a few long-range contacts could be identified. These non-sequential cross-peaks are indicative for an anti-parallel orientation of strands β1 و β3, which are bridged by the β-hairpin inducing D-Pro-Gly sequence (Fig. 2).

Section of the NOESY spectrum of free CHOPS in solution. Several cross-peak assignments are shown indicative for the presence of a β-hairpin comprising strands β1 و β3

Titration of CHOPS with the unsulfated receptor mimic C5aR7–28 did not result in any changes in the 1 H-spectrum of the latter. In contrast, titration of CHOPS with the sulfated receptor mimic C5aR7–28س2 resulted in increased dispersion of resonance lines, which is characteristic for non-random coil behavior (Supplementary Figure 4b). The complex between CHOPS and C5aR7–28س2 is still flexible and the 1 H-spectra show a high degree of overlap. Nevertheless, we could assign some of the NMR signals as indicated in Supplementary Figure 4b. These new signals are at comparable positions as in spectra of the complex between CHIPS31–121 and C5aR7–28س2, and indicative for the formation of native-like structure. Similar features were observed in 1 H– 13 C HSQC spectra upon titration of C5aR7–28س2 to CHOPS (Fig. 3).

1 H– 13 C HSQC spectra of CHOPS. أ Methyl group region of the 1 H– 13 C HSQC spectrum free CHOPS. ب Similar spectrum of CHOPS in complex with receptor mimic C5aR7–28س2. The assignments are indicated. Peaks originating from C5aR7–28س2 تظهر في italic font

The NOESY spectra of the CHOPS:C5aR7–28س2 complex suffer from severe overlap, but still a limited number of long-range intra-molecular and inter-molecular NOE cross-peaks could be assigned. Inter-molecular NOEs were identified between the aromatic side-chain protons of sulfated tyrosine sY14 of C5aR7–28س2 and the side-chains of T53 (Fig. 4a) and Y108 (Fig. 4c) of CHOPS. ح13 of C5aR7–28س2 has an NOE contact with V109 of CHOPS (Fig. 4b). Intra-molecular NOEs were identified between T53 and L49 and between Y97 and V109 (Fig. 4a). Similar peaks were observed in NOESY spectra of the complex between CHIPS31–121 and C5aR7–28س2. The position of these residues in the NMR structure of the CHIPS31–121:C5aR7–28س2 complex is indicated in Fig. 4d, e.

Observed cross-peaks in the NOESY spectrum of the CHOPS:C5aR7–28س2 complex in relation to structural features of the CHIPS31–121:C5aR7–28س2 complex (PDB ID code: 2K3U). أ ج Different sections of the NOESY spectrum recorded at 288 K of a 1:1 mixture of CHOPS and C5aR7–28س2. Identified long-range intra-molecular and inter-molecular NOE cross-peaks are indicated (normal fonts for residues belonging to CHOPS and italic fonts for residues belonging to C5aR7–28س2). د ه Cartoon representation of the structure of the CHIPS31–121:C5aR7–28س2 complex. The side-chains of the residues identified in أ ج تظهر في stick representation. NOE cross-peaks observed in أ ج are indicated by arrows in the structure

CD spectroscopy

The presence of residual structure in the C5aR mimics and CHOPS was also monitored by CD spectroscopy. The CD spectra of the C5a-receptor mimics C5aR7–28 and C5aR7–28س2, and CHOPS show no structural features apart from a shallow minimum at 200 nm (Fig. 5). The CD spectrum of free CHIPS31–121 comprises a large positive signal around 190 nm and a minimum around 205 nm (Fig. 5). This spectrum does not change significantly upon binding of C5aR7–28س2 (البيانات غير ظاهرة). Titration of CHOPS with a stoichiometric amount of unsulfated receptor mimic C5aR7–28 resulted in an increase of the CD signal, although the shape of the spectrum did not change (Fig. 5a). Stoichiometric titration of CHOPS with sulfated receptor mimic C5aR7–28س2, on the other hand yielded a clear change of the CD spectrum: an increase in the signal around 190 nm and a shift of the minimum from 200 to 205 nm (Fig. 5b). These changes shift the appearance of the CD spectrum towards that of CHIPS31–121 although at lower intensities.

Circular dichroism spectra (CD) of CHOPS, CHIPS31–121 and C5aR mimics. أ CD spectra of CHOPS, C5aR7–28, CHOPS:C5aR7–28, and CHIPS31–121. ب CD spectra of CHOPS, C5aR7–28س2, CHOPS:C5aR7–28س2, and CHIPS31–121

In this study we aimed to create a shorter version of the immune evasive protein CHIPS based on the NMR structure of the complex between CHIPS31–121 and C5aR7–28س2. The construct we designed (CHOPS) comprises all portions of CHIPS31–121 important in the interaction with the C5aR. Portions outside the binding region including strand β2 and the connecting loop between β2 و β3 were discarded. This was accomplished by coupling strand β1 و β3 together via a D-Pro-Gly linker segment. The resulting 50-residue long peptide appeared to be largely unfolded apart from some residual structure around the β-hairpin inducing D-Pro-Gly linker sequence. ITC studies revealed that CHOPS binds to the doubly sulfated C5a-receptor mimic C5aR7–28س2 with micromolar affinity (ك د = 3.6 ± 0.2 μM). Although the affinity of C5aR7–28س2 to CHOPS is three orders of magnitude lower compared to binding to CHIPS31–121 (ك د = 8.4 ± 1.2 nM Ippel et al. 2009), this is a very promising result for a first lead compound. No detectable affinity of CHOPS was observed in the ITC measurements using the unsulfated mimic C5aR7–28. This is consistent with previous measurements of CHIPS31–121 and C5aR7–28, which revealed that the absence of the two sulfate moieties results in an almost 400-fold decrease in affinity.

NMR spectroscopy confirmed the results obtained by ITC. Titration of CHOPS with unsulfated receptor mimic C5aR7–28 resulted in the sum of its constituent 1 H-spectra, while titration of doubly sulfated peptide C5aR7–28س2 yielded a completely different 1 H-spectrum with signals shifted from their random coil position. The latter is indicative for the formation of defined structural elements. The NMR titration experiments using C5aR7–28س2 showed binding in a fast-exchange regime, compatible with the observed micromolar affinity by ITC (Cavanagh et al. 2007). Several characteristic features observed in spectra of the CHIPS31–121:C5aR7–28س2 complex were also present in spectra of CHOPS:C5aR7–28س2. Specific resonances of residues L49, T53, T96, Y97, Y108, V109 and N111 have chemical shifts comparable with their counterparts in the CHIPS31–121:C5aR7–28س2 complex. We also observed NOE cross-peaks between residues sY14, T53, L49, and Y108 and between residues H13, V109, and Y97 in NOESY spectra of CHOPS:C5aR7–28س2. These peaks are reminiscent of NOE contacts observed in spectra of the complex between CHIPS31–121 and C5aR7–28س2 and reveal that CHOPS, in the presence of sulfated peptide C5aR7–28س2, adopts similar structures as native CHIPS31–121.

The structural characteristics of CHOPS, either free in solution or in complex with the C5aR mimics, were also studied by CD spectroscopy. The spectra of the separate peptides (CHOPS, C5aR7–28 or C5aR7–28س2) did not show any significant absorption apart from a shallow minimum around 200 nm. Titration of CHOPS with receptor mimic C5aR7–28 increased the amount of absorption, but not the position of its minimum. Titration of CHOPS with the doubly sulfated receptor mimic C5aR7–28س2 caused an increase in absorption around 190 nm as well as a shift of the absorption minimum from 200 to 205 nm. Although the maximum and minimum intensities are smaller, the overall shape of the CD spectrum of the CHOPS:C5aR7–28س2 complex resembles that of native CHIPS31–121.


What is the maximum length of a peptide and minimum length of a protein?

Also, linking to an article would be nice, I know what wikipedia says.

Interesting question. A peptide is technically any two or more amino acids linked by a peptide bond, so there is no maximum size. All proteins are peptide chains, the largest one in humans is titin, a spring-like muscle protein comprised of 34350 amino acids. Its virtually impossible to work with biochemically as a whole. Probably, there are bigger peptides out there.

Protein can also be used to refer to any peptide chain and in nutrition I believe it refers simply to amino acid content. There is no strictly delineated minimal size.

In terms of usage, protein generally refers to a complete gene product, whatever its size. Protein fragment is used to refer to incomplete gene products greater than 30-40 amino acids in length, and peptide is used to refer to everything smaller.


أساليب

استنساخ

In order to introduce an arginine followed by a stop codon in T2i88-8-pf [21] site-directed mutagenesis PCR was used. The resulting plasmids were transformed into الإشريكية القولونية strain DH5α by heat shock. The resulting ampicilin-resistant colonies were screened for the recombinant gene by sequencing after miniprep (Promega, Madison, WI, USA). Plasmids harboring the desired genes were transformed into the الإشريكية القولونية strain BL21(DE3) expression cells (Novagen, Gibbstown, NJ, USA) and a 20 % glycerol stock of each construct (3HR, 2.5HR و 2HR) was stored at −80 °C.

Protein expression

An overnight culture (50 ml) of BL21(DE3) (Novagen, Gibbstown, NJ, USA) cells containing the expression construct was added to LB (3L) supplemented with ampicillin (Fisher, Pittsburgh, PA, USA, 6 ml, 100 mg/ml). The culture was incubated (190 rpm, 37 °C) until the OD600 reached

0.5–0.6, at which time protein expression was induced (IPTG, Fisher, Pittsburgh, PA, USA, 3 ml, 1 M) and the culture incubated further (190 rpm, 37 °C, 3 h). The cells were isolated by centrifugation (4000ز, 12 min), and the pellet was stored at −80 °C.

تنقية البروتين

Purification was done under denaturing conditions (9 M urea). Cell pellet was thawed on ice, resuspended in lysis buffer A which is composed of 9 M Urea, 100 mM NaH2ص4, 10 mM Tris and 10 mM β-mercaptoethanol, pH 8.0 and lysed by sonication (SONICATOR → 3000 Ultrasonic Liquid Processor, cycle of 4 s pulse at 55 % amplitude followed by a 6 s rest repeated for a 10 min period). The insoluble cell debris was cleared by centrifugation (45 min at 30,500ز). The supernatant was then incubated with nickel beads (Qiagen, Valencia, CA, USA) for one hour. Possible DNA contamination was removed by a wash with buffer B at pH 8.0: 9 M Urea, 500 mM NaH2ص4, 10 mM Tris, 10 mM imidazole. Protein contaminants were washed from the column using a pH gradient and 10 mM imidazole in the buffers. The first wash was done with lysis buffer A and the second and third washes at pHs 6.3 and 5.9 respectively with a buffer containing 9 M Urea, 100 mM NaH2ص4, 20 mM sodium citrate, 10 mM imidazole and 10 mM β- mercaptoethanol. Elution was done at pH 5.2 and pH 4.5 again with 9 M Urea, 100 mM NaH2ص4, 20 mM sodium citrate, 10 mM imidazole and 10 mM β-mercaptoethanol. Any protein that did not elute at the lower pH washes was eluted with buffers containing high concentration of imidazole (buffer C: 9 M Urea, 100 mM NaH2ص4, 10 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 8.0 or buffer D: 9 M Urea, 100 mM NaH2ص4, 10 mM Tris, 500 mM imidazole, pH 8.0).

Protein purity was verified by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (15 % gel). Following purification, the denatured monomeric peptides were refolded using one of the following three methods: (1) dialysis performed in a stepwise manner (stepwise refolding) (2) one step dialysis against a buffer with no urea (direct refolding) or (3) concentrated (Amicon Ultra centrifugal filter devices, Millipore, Billerica, MA, USA) and diluted to a buffer with no urea (quick refolding). The proteins were filtered with a 0.1 μm polyvinylidene fluoride membrane filter before and after dialysis (Millipore, Billerica, MA, USA, #SLVV 033 RS).

For all three designs (3HR, 2.5HR و 2HR) the protein concentration was calculated using the absorbance at 280 nm with the extinction coefficient (M −1 cm −1 ) and molecular weight (Daltons) of the protein. The extinction coefficient and molecular weight were obtained with ExPASy’s ProtParam tool (http://ca.expasy.org/tools/protparam.html).

Dynamic light scattering

The hydrodynamic diameter was obtained with a Malvern Zetasizer Nano S equipped with a 633 nm laser using a 3 mm path length quartz suprasil cell. The measurements were done at 25 °C and for each protein five scans were collected.

Transmission electron microscopy

Transmission Electron Microscopy samples were negatively stained with 1 % uranyl acetate (SPI) at a peptide concentration of 50 μg/ml. Electron micrographs were taken with a Philips EM 300 transmission electron microscope at an accelerating voltage of 80 kV. The micrographs were scanned at 600 dpi.

Model building

A starting model of the nanoparticle peptide was built using the crystal structures of the helix-turn-helix motif of the channel-forming domain of colicin E1 [24], the tryptophan zipper [25] and a de novo designed trimeric coiled-coil peptide [26] as templates for the linker, the N-terminal pentameric domain and the C-terminal trimeric domain, respectively (Fig. 1a). The model building (Fig. 1b) was done in silico using the graphics program ‘O’ version 12.0.1 [27].

Molecular dynamics simulation

Eleven different constructs were studied by molecular dynamics (MD) simulations with CHARMM 36b1 [28] installed on a Linux cluster at the Biotech Center of the University of Connecticut. The whole MD simulation procedure is divided into five steps: vacuum minimization, solvation, energy minimization, heating and equilibration, and production dynamics. The peptide molecule was solvated and ions were added to achieve a particular salt concentration. In the energy minimization step, we used the steepest descent (SD) method for 50 steps followed by the adopted basis Newton–Raphson (ABNR) method for 50,000 steps, where each step is 1 fs. After the energy minimization of the whole system, the temperature was raised slowly to 300 K from an initial temperature of 100 K at a rate of 10°/1000 steps to relax the molecule and then to run the equilibration for a total time of 100 ps, including the time to raise the temperature. Production dynamics for 2 ns were run thereafter on the whole system for initial screening. Long 10 ns production dynamics were also performed on selected models to find the best one. To analyze the final models, we have calculated root mean square deviation (RMSD) and radius of gyration (RGYR) with respect to the energy minimized structure using CHARMM algorithm [28].


مقدمة

Novel coronaviruses are large enveloped single-stranded RNA viruses (size ranging from

32 kb in length) in the coronaviridae family that cause the common cold, influenza-like illness and more serious acute respiratory illnesses, including pneumonia, exacerbations of underlying lung disease, croup and bronchiolitis [1–3]. The subgroups of coronavirus families are alpha (α), beta (β), gamma (γ) and delta (δ) coronaviruses. In particular, this virus was reported to be a member of the β group of coronaviruses. The novel virus was Wuhan coronavirus or 2019 novel coronavirus (2019-نCoV) by the Chinese [4–7]. The International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) named the virus SARS-CoV-2 and the disease COVID-19 [8–10]. Globally, to date, there has been 1 death every

358 people in the general population. In addition, 89% of the time, the person who died had one or more underlying medical conditions. A total of

8,256,725 coronavirus cases in approximately

3.4% of reported COVID-19 cases have died according to the COVID-19 outbreak [4–7] as of June 17, 2020, 02:16 GMT. By comparison, seasonal flu generally kills far fewer than 1% of those infected [9], estimated by simply looking at the value of current total deaths plus current total recovered and pairing it with a case total in the past that has the same value, i.e.,

445,959/(445,959 + 4,306,426) = 9% CFR (crude fatality ratio) worldwide [11].

Since the 1930s, when the coronavirus family of viruses was first identified, until now commercially, there have been no successful vaccines or antiviral drugs that have been able to prevent or treat infections for COVID-19, and past and current vaccine development efforts against this disease might be of high value for the development of an effective vaccine for COVID-19 [12–14]. According to the WHO,

41 candidate vaccines are being developed for COVID-19 from different countries as of March 13, 2020 (WHO 15 Mar 2020). Many research teams worldwide have been working on monoclonal and polyclonal antibodies against novel coronaviruses produced in vitro using tissue culture techniques, but few of them have entered into trials. Monoclonal antibodies are generally very rarely used in the treatment of infectious diseases. As polyclonal antibodies are composed of a mixture that represents the natural immune response to an antigen, they are prone to a higher risk since they are not all successful. Second, drugs and small molecules can calm the immune system, but patients become seriously ill when their immune system overreacts and starts causing collateral damage to the body. The US Food and Drug Administration today dated June 4, 2020, announced the following actions taken in its ongoing response effort to the COVID-19 pandemic. Dexmedetomidine hydrochloride in

0.9% sodium chloride injection (ANDA-209307) [15] and hydroxychloroquine and chloroquine to treat COVID-19 [16], but side effects such as irregular heartbeats, dizziness or fainting, require medical attention immediately. Another drug use of remdesivir in treatment of COVID-19 is having current drug with possible mechanism of action and chemistry of remdesivir against viral infection [12–14].

The inhaled virus SARS-نCoV-2 likely binds to epithelial cells in the nasal cavity and starts replicating [17]. Human angiotensin-converting enzyme-2 (hACE2) is the main receptor for cell entry in both SARS-CoV and SARS-نCoV-2 outbreaks [18, 19]. The spike glycoprotein (S) on the surface of coronaviruses is essential for virus entry through binding to the hACE2 receptor and for viral fusion with the host cell [20]. Thus, one could target this interaction site between hACE2 and SARS-نCoV-2 spike protein with antibodies or small drug molecules [21]. In vitro data with SARS-نCoV-2 indicate that ciliated cells are primary cells infected in the conducting airways [22]. At this time, the disease COVID-19 is clinically manifest. Overexpression of hACE2 enhanced the disease severity in a physiologically relevant model for investigating hACE2 as a therapeutic target for antiviral intervention against the COVID-19 pandemic. Without a vaccine, we should not think of herd immunity as a light at the end of the tunnel. A vaccine is the only lifetime way to move directly from susceptibility to immunity, bypassing the pain from becoming infected and possibly dying. Moreover, the aim of this study is to focus on identifying selected fragmented (protein subunit) genetic code of antigenic epitope peptides from each novel coronavirus protein domain such as spike protein (S), membrane glycoprotein (M), envelop protein (E) and nucleocapsid protein (N) of the virus and use that as our vaccine. When the vaccine is injected into the body, muscle cells naturally “amplify” it by producing copies of each antigenic epitope peptide from each protein domain, which the immune system detects as a threat. This trains the body’s immune system to defend against novel coronaviruses to produce specific antibodies, such as IgG, IgA, IgM and IgM, by recognizing all antigenic peptides. Finally, only a solution is vaccine that produces antibodies by our own body’s β-cells to fight off infections by novel coronavirus other than any side effects.


VLPs for vaccination against cancer

A strong cytotoxic T lymphocyte (CTL)-mediated immune response is a major factor in eradicating tumor cells and the ability of VLPs to induce these responses by delivering antigen to the cytosol and activating the MHC class I pathway makes them excellent candidates for development of vaccines in the treatment of cancer. Several important elements of the immune system play a role in targeting cancer cells. First, DC cells must receive sufficient signals to mature and stimulate adaptive immunity. This is important to ensure that the immune system does not become tolerant to the antigen by activating regulatory T cells (Tregs) and suppressing the immune system. Second, most cancer antigens are related or identical to self-antigens. Finally, T cells must be able to overcome the immune-suppressive signals generated by tumor cells. VLPs have features that allow them to address these challenges. In this section, we consider the VLP-based vaccines that have been explored as potential anti-tumor treatments [185].

VLP-based vaccines developed against cervical cancer

Some viral infections can lead to cancer. For example, HPV is one of these viruses, especially the two types HPV16 and HPV18, which cause 70% of cervical cancer cases [186]. The virus also causes other cancers such as anal, head, and throat and genital warts. HPV capsid consists of two important proteins called L1 (major) and L2 (minor) proteins. Two commercial vaccines, Merck’s Gardasil®, and GlaxoSmithKline’s Cervarix® have been developed to prevent HPV-related cancer. The expression systems of these two L1-based VLP vaccines are yeast and insect cells, respectively. However, these two vaccines can only prevent cancer associated with genotypes 16 and 18 (Gardasil also protects against genotypes 11 and 6, which cause benign genital warts), and do not protect against other HPV genotypes. Meanwhile these prophylactic vaccines do not cure infected people. Therefore, researchers are still trying to develop a more efficient vaccine. It has been observed that two tumor-specific antigens called E6 and E7 are expressed in all HPV infected cells and increased in cervical tumor cells [187]. E6 inactivates the P53 by binding to ubiquitin ligase E6AP and E7 degrades the phosphorylated retinoblastoma tumor suppressor pRb [188]. Thus, these two proteins repress two critical tumor suppressor proteins. HPV VLP-based vaccines are mainly L1-based because this protein can form VLP. But because the L1 is not conserved between different types of HPV, the researchers have also focused on L2 based vaccine development [189, 190]. However, the L2 challenge is its inability to form VLP [189, 191]. The concatemers consists of tandem or conserves sequences of several HPV types were designed on the MS2 bacteriophage-based VLP vaccine and the mice immunized with the construct produced high antibody titers. They also protected against different types of HPV (16, 18, 31, 33, 45 and 58) in challenge test, as the latest version of the commercial VLP-based vaccine, Gardasil9 [192]. In another study, the bacteriophage AP205 capsid-based VLP with the surface display of the HPV L2-protein and VAR2CSA placental malaria antigen was developed to protect against two diseases, cervical cancer and PM infection, simultaneously. The results showed that this system can induce humoral immunity to protect mice in challenge against both diseases [193].

VLP-based vaccines developed against Breast cancer

Breast cancer is the most common cancer in women and affects men as well (https://www.who.int/). 20–30% of cases of invasive breast cancer is associated with overexpression of human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) that is involved in the proliferation and inhibition of programmed cell death [194, 195]. The induction of passive immunogenicity using monoclonal antibodies has been effective in preventing metastasis and tumor growth, but this method is costly, requires multiple administrations at regular intervals for long-term protection and has undesirable side effects [196, 197]. VLP-based vaccines have been shown to address these challenges. Active vaccination with a VLP-based vaccine derived from Acinetobacter phage AP205 coat protein, with surface displayed HER2 protein, was evaluated in FVB mice which had been transplanted with human HER2-positive breast cancer cells. This showed that vaccination was able to inhibit tumor growth in the mice. This approach induced strong humoral immunity and also overcame immune system tolerance [198]. The product of the SLC7A11 gene, xCT, is a transmembrane protein that is overexpressed in cancer stem cells and is a target in breast cancer therapy. This protein activates Treg cells, reduces glutathione synthesis, and helps to encourage tumor invasion as Treg cells suppress the immune system to promote immune tolerance to the tumor cells [199]. A bacteriophage MS2 VLP-based vaccine that displayed the extracellular loop of xCT transporter on its surface was used to treat mice carrying metastatic breast cancer cells. The treated animals produced high levels of specific antibodies and reduced metastasis [200]. Bolli et al. developed the AX09-0M6 as a VLP-based vaccine platform by displaying of the human xCT extracellular domain (ECD6) on its surface. In vaccinated BALB/c mice the neutralizing IgG2a titer was significantly increased and the growth of breast cancer stem cells, xCT activity and pulmonary metastasis was decreased [201].

VLP-based vaccines developed against pancreatic cancer

The cell surface glycoprotein, Mesothelin (MSLN), is overexpressed in many cancers, including pancreatic cancer, and is seen used as a potential anti-cancer drug target. This glycoprotein is involved in cell adhesion and causes cancer cell masses to attach to mesothelial cells. A VLP-based on SHIV VLPs with murine MSLN displayed on the surface of the particles was used to immunize mice harboring pancreatic tumor cells [202]. Following vaccination, tumor growth was inhibited and 60% of the treated mice survived. The VLP strongly stimulated both specific anti-tumor antibody production and CD8 + T cell immunity. It also prevented self-antigen suppression by inhibiting Treg cells.

An alternative therapeutic target for pancreatic cancer treatment is the transmembrane glycoprotein Trop2, which is also overexpressed in other cancers [203]. This protein has little or no expression in healthy epithelial tissue. A simian immunodeficiency virus (SIV) VLP-based vaccine presenting the Trop2 protein was examined for its efficacy against syngeneic pancreatic cancer in C57BL/6 mice [204]. Vaccinated mice showed reduced tumor growth and the VLP-based vaccine significantly activated CD4 + , CD8 + , and the natural killer cell population. Moreover, the population of Treg and myeloid‐derived suppressor cells in the tumor microenvironment was decreased. Decreased expression of immunosuppressive cytokines such as IL-10 and TGF-β confirmed that the treatment inhibited tumor-suppressing immune signals induced by the tumor cells [204].

VLP-based vaccines developed against melanoma

Melanoma is the cause of 10% of all skin tumors and more than 90% of deaths due to skin cancer [205]. A VLP-based vaccine derived from the plant CPMV was used to assess the capacity of and empty CPMV VLP (eCPMV) to suppress tumor growth. Culture medium containing bone marrow-derived DCs (BMDCs) and primary macrophages derived from C57BL6 mice were treated with eCPMV and after 24 h an increase in the expression of some cytokines, such as IL-1β, IL-6, IL-12p40, Ccl3 (MIP1-α), and TNF-α was observed. Treatment of B16F10 lung melanoma cells with eCPMV altered tumor microenvironment immune cell organization. Tumor-infiltrating neutrophil (TIN) numbers were increased and conversely the immune-suppressing cells such as CD11b− Ly6G+ neutrophils were decreased. The mechanism of action of the vaccine was investigated using null mutant mice lacking neutrophils and cytokines IL-12 and IFNγ. In these mice, vaccination was not effective against the tumor and the vaccine did not show its protective anti-tumor effects. This strongly suggests that the beneficial effect was immune-mediated and that neutrophils and IL-12 and IFNγ played a key role in the antitumor effects [206]. The bacteriophage Qβ-based VLP system coupled with TLR9 ligands, in which the surface of each VLP was loaded with one of the Germline or mutated CTL epitopes of B16F10 were also investigated as a potential therapy with positive results. In vaccinated C57BL/6 mice with a mixture of both types of VLP the population of CD8 + T cells specific for the B16F10 murine melanoma significantly increased and tumor progression was inhibited leading to increased survival of the mice. All three types of VLPs were able to provide a degree of protection but the mixture of the two provided significant protection and prevented the progression and invasion of B16f10 cells changed the tumor microenvironment by increasing Ly6G+ granulocytic cells and decreasing Ly6C+ monocytic population [207]. These results indicate that activation of a CD8 + T cell mediated immune response is essential for vaccine efficacy in cancer prevention. In a study to analyze the importance of adjuvant size in stimulating T cell immunity and to evaluate the immune response in a mice model of melanoma a VLP-based platform derived from CMV and incorporating tetanus toxoid epitope TT830–843 (CMVTT-VLP) was established. The p33 peptide epitopes as a model antigen, derived from Lymphocytic choriomeningitis virus, was displayed on the particle surface and the CuMVTT-p33 VLP vaccine was formulated with micron-sized microcrystalline tyrosine (MCT) adjuvant. Comparison of the results with commercial adjuvants, Alum and B type CpGs showed that the micron-sized adjuvant stimulated CD8 + T cell immunity as much as CpG but more potent than Alum. The VLP-based vaccine showed notable antitumor effects against the B16F10 murine tumor cells [208]. VLP-based vaccines for cancer prevention have opened a new era in vaccine research, and although the results so far look promising, more research is needed to reach a definitive conclusion about the effectiveness of these vaccines. The summary of the VLP-based vaccines against different cancers are listed in Table 2.


خلفية

شيغيلا is the causative agent of shigellosis, a severe acute gastrointestinal infection that frequently presents as bloody diarrhea, fever, and severe abdominal pain [1]. في عام 2016 ، شيغيلا was estimated to cause > 250 million cases and > 200,000 deaths globally [2]. Higher income countries experience شيغيلا infections among travelers, aging populations, deployed military personnel, and men who have sex with men (MSM) [2, 3]. However, the preponderance of the شيغيلا disease burden is in children aged under 5 years residing in low-middle income countries (LMICs). Infection in this vulnerable group can also result in significant long-term consequences such as severe stunting and impaired cognitive development [2, 4]. The global epidemiology of شيغيلا is worsened by the emergence and spread of multi- and extensively drug resistant (MDR and XDR) variants, making infections increasingly difficult to treat [5]. The principal method of شيغيلا prevention has been improvements in water, sanitation, and hygiene (WASH) [6]. However, due to the low infectious dose, the standard of WASH required to break transmission is difficult to attain in many LMICs [7]. Furthermore, recent application of molecular techniques to identify شيغيلا infections found a severe underestimation of the global شيغيلا burden [8, 9], highlighting the need for new low-cost prevention techniques.

There is currently no licensed vaccine against شيغيلا [10]. However, studies in animals and controlled human infection models (CHIMs) have shown that protection through immunization is feasible [11, 12]. Natural disease epidemiology in humans and non-human primate infection studies show complete protection from re-infection with a homologous شيغيلا محيط. Long-term homologous protection has been attributed to serotype-specific systemic (serum IgG) and mucosal (IgA) antibody responses [12, 13]. The most immunodominant target of the شيغيلا IgG and IgA response is the O-antigen component of lipopolysaccharide (LPS) [14, 15]. LPS/O-antigen-specific antibodies elicit protection through antibody-mediated opsonization, phagocytosis, and intracellular cytotoxicity [13]. However, antibodies against شيغيلا O-antigen are highly specific for the infecting species only [11, 13], and do not provide protection against heterologous شيغيلا محيط. منذ شيغيلا genus consists of four species and > 50 serotypes, a lack of cross-protection against heterologous species and serotypes poses a major challenge for vaccine development [16]. This challenge may be overcome by a vaccine that elicits either a broadly reactive immune response or numerous species-specific responses against the globally dominant شيغيلا species (i.e., S. flexneri و S. sonnei) [17].

The primary strategy of developing an efficacious شيغيلا vaccine has been to elicit antibody responses targeting شيغيلا O-antigen [10]. Live-attenuated vaccines with genetically attenuated شيغيلا [18,19,20], or the expression of شيغيلا O-antigen on live-attenuated vectors [21], have been shown to induce good antibody responses against O-antigen. Multivalent killed-vaccines also induce high titers of serum IgG and mucosal IgA targeting شيغيلا O-antigens and have shown protection in early clinical development [22, 23]. Recombinant forms of شيغيلا O-antigen have also been pursued as vaccine candidates [10], with a شيغيلا O-antigen conjugated to a carrier protein [24,25,26], which engages T cell help and produces a longer lasting antibody response to the polysaccharide antigen [27]. Various immunogenic proteins, such as the toxins from other pathogens, have been used as carrier proteins [28, 29]. However, protein antigens from شيغيلا have not been evaluated as a carrier protein for شيغيلا O-antigen.

Whole genome sequencing provided the ability to predict and derive novel antigens for use as vaccines, and this approach ultimately gave rise to the meningococcal B vaccine [30,31,32]. Further technological advances in immunology and protein engineering to study the interaction of pathogens with the immune system can aid in reverse engineering of protective immunogens [33,34,35]. Here, we aimed to identify novel immunogenic شيغيلا antigens that could serve as شيغيلا vaccine candidates, either alone, or when conjugated to شيغيلا O-antigen. Therefore, we conducted immunogen prediction using bioinformatic analysis, then created a protein microarray of predicted immunogenic شيغيلا antigens. These expressed antigens were screened for immunogenicity using polyclonal antibodies from patients who recovered from confirmed شيغيلا infections, to identify a novel set of proteins which may facilitate the development of novel شيغيلا vaccines.


Example 8

The following fusion proteins are generated PE313-NES-antigen-K, PE1-252-PE268-313-NES-antigen-K, PE1-252-PE280-313-NES-antigen-K. In addition, the fragment of PE domain Ia (PE1-252) of the fusion protein PE313-antigen-NESK is replaced by RAP1 domain 3 (SEQ ID NO: 8). A2M minimum (SEQ ID NO: 9), HIV-Tat minimum (SEQ ID NO: 10) or HSPs minimum (SEQ ID NO: 11) to generate the fusion proteins RAP1 domain 3-PE253-313-antigen-NESK, A2M-PE253-313-antigen-NESK, Tat-PE253-313-antigen-NESK and HSP-PE253-313-antigen-NESK, RAP1 domain 3-PE268-313-antigen-NESK, A2M-PE268-313-antigen-NESK, Tat-PE268-313-antigen-NESK and HSP-PE268-313-antigen-NESK vaccines, RAP1 domain 3-PE280-313-antigen-NESK, A2M-PE280-313-antigen-NESK, Tat-PE280-313-antigen-NESK and HSP-PE280-313-antigen-NESK, respectively. RAP1 domain 3-PE253-313-NES-antigen-K, A2M-PE253-313-NES-antigen-K, Tat-PE253-313-NES-antigen-K and HSP-PE253-313-NES-antigen-K, RAP1 domain 3-PE268-313-NES-antigen-K. A2M-PE268-313-NES-antigen-K, Tat-PE268-313-NES-antigen-K and HSP-PE268-313-NES-antigen-K vaccines, RAP1 domain 3-PE280-313-NES-antigen-K. A2M-PE280-313-NES-antigen-K, Tat-PE280-313-NES-antigen-K and HSP-PE280-313-NES-antigen-K. The cell mediated immune responses enhanced by these vaccines are examined using similar methods as described above.

Table 1 shows SEQ ID NOs. of peptides used for making various fusion proteins.

In summary, the results have proved that a fusion protein containing an APC-binding domain at the N-terminal end, a translocation domain, followed by an antigen of a pathogen, and then a fusion peptide of NESK at the carboxyl terminal end is an improved design over the PE-fusion protein that is without the fusion peptide of NESK at the carboxyl terminus in terms of enhancing cell-mediated immune response, suppressing tumor growth, and/or increasing the percentage of tumor-free animals.

While embodiments of the present invention have been illustrated and described, various modifications and improvements can be made by persons skilled in the art. It is intended that the present invention is not limited to the particular forms as illustrated, and that all the modifications not departing from the spirit and scope of the present invention are within the scope as defined in the appended claims.

The embodiments and examples were chosen and described in order to explain the principles of the invention and their practical application so as to enable others skilled in the art to utilize the invention and various embodiments and with various modifications as are suited to the particular use contemplated. Alternative embodiments will become apparent to those skilled in the art to which the present invention pertains without departing from its spirit and scope. Accordingly, the scope of the present invention is defined by the appended claims rather than the foregoing description and the exemplary embodiments described therein.

Some references, which may include patents, patent applications and various publications, are cited and discussed in the description of this invention. The citation and/or discussion of such references is provided merely to clarify the description of the present invention and is not an admission that any such reference is “prior art” to the invention described herein. All references cited and discussed in this specification are incorporated herein by reference in their entireties and to the same extent as if each reference was individually incorporated by reference.


شاهد الفيديو: أكثر 16 أغذية غنية بالبروتين تساعدك على بناء عضلات جسمك (كانون الثاني 2022).